Nós introduzimos um romance de fluxo de trabalho para investigações de microscopia eletrônica do tecido cerebral. O método permite ao usuário examinar características neuronais de forma imparcial. Para a análise elementar, apresentamos também um script que automatiza a maior parte do fluxo de trabalho por amostragem aleatória.
Investigações sobre as características ultra-estruturais de neurônios e suas sinapses só são possíveis com microscopia eletrônica. Especialmente para estudos comparativos das mudanças na densidade e distribuições de tais características, um protocolo de amostragem imparcial é vital para resultados confiáveis. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho para a aquisição de imagens de amostras de cérebro. O fluxo de trabalho permite a amostragem aleatória uniforme sistemática dentro de uma região do cérebro definidos, e as imagens podem ser analisadas usando um disector. Esta técnica é muito mais rápida do que o exame aprofundado das seções seriais mas ainda apresenta uma abordagem viável para estimar as densidades e distribuições de características de ultra-estrutura. Antes da incorporação, seções manchadas vibratome foram usadas como referência para identificar a região do cérebro sob investigação, processo que ajudou acelerar a preparação da amostra global. Esta abordagem foi utilizada para estudos comparativos, investigando o efeito de um ambiente enriquecido-habitação em vários parâmetros ultra-estruturais no cérebro do rato. Baseado no uso bem sucedido de fluxo de trabalho, adaptamos para efeitos de análise elementar de amostras de cérebro. Nós aperfeiçoamos o protocolo em termos do tempo de interação com o usuário. Automatizar todas as etapas demoradas através da compilação de um script para o software de código aberto SerialEM ajuda o utilizador a focar o trabalho principal de adquirir os mapas elementares. Como o fluxo de trabalho original, nós pagamos a atenção à abordagem imparcial de amostragem para garantir resultados confiáveis.
Em microscopia eletrônica, muitas vezes é desafiador, para amostra representativas regiões em seções. Nós, como um observador, são muitas vezes tendenciosa para olhar para regiões específicas, atraídas a nossa atenção à conspícuas características da amostra, impedindo uma amostragem bem distribuída, imparcial. Viés de amostragem só pode ser evitado se cada parte da região de interesse Obtém a mesma chance de acabar em uma micrografia eletrônica1. É possível evitar o viés de amostragem sem uma solução de software, por exemplo, empurrando o trackball do microscópio manualmente sem olhar para a imagem, a fim de selecionar regiões de amostragem onde para o palco. Mas, estritamente falando, isto não é um procedimento aleatório, porque, consciente ou inconscientemente, o usuário pode ter uma influência sobre o movimento do palco, e, além disso, isto não é uma forma sofisticada de selecionar regiões de amostragem. Amostragem aleatória torna-se especialmente importante se pares de seções são usadas para avaliar o número de estruturas em um determinado volume, por exemplo, para stereology1, que exige que pares de seções, uma distância conhecida separada. Também seria possível olhar apenas para uma única seção e estimar o número de estruturas específicas2, mas com essa abordagem os investigadores tendem a superestimar a densidade numérica de estruturas maiores, a menos que as estruturas são muito pequenas em comparação com a espessura de corte. Abordagens alternativas são para reconstruir volumes de tecido do seriais seções e, assim, obter os dados desejados3. Mas isto é muito demorado e não uma abordagem viável para estudos comparativos (maiores).
Para superar esses problemas, nós desenvolvemos um fluxo de trabalho que permite que o pesquisador selecione automaticamente amostras para obtenção de micrografias de elétron no espaçamento regular dentro de seções ultra-finas. A posição de micrografias da elétron é aleatória, permitindo que a amostragem imparcial. A abordagem é adequada tanto para determinar a densidade numérica de estruturas (por exemplo, sinapses dentro de um determinado neurópilo volume4,5) e as dimensões das características estruturais (por exemplo, a largura da fenda sináptica, ou o diâmetro do densidade pós-sináptica4,,5).
O fluxo de trabalho usa um ponto aleatório feito por amostragem (RPS) software (escrito em Java script usando software de criação de scripts fornecido com nosso microscópio) que calcula automaticamente as posições de grade dentro de uma região predefinida de interesse em uma seção ultra fina. O software RPS move o palco o microscópio de elétron para estes pontos predefinidos, para que uma micrografia eletrônica pode ser feita em cada ponto. Primeiro, o usuário define uma região de interesse dentro da seção fina. Em seguida, o software RPS calcula as posições de grade dentro desta região. A x / y coordenadas da posição do primeira são criadas aleatoriamente, e as posições restantes são colocadas em intervalos de grade regular em relação à primeira posição. Porque cada parte da região de interesse tem a mesma chance de ser examinado, isto permite a coleta de dados mínima. Esta abordagem de amostragem também é chamada de amostragem aleatória uniforme sistemática (ver referências6,7 para mais detalhes).
Para a determinação da densidade numérica de estruturas, trabalhamos com pares de seções que estão separados a uma distância conhecida. Depois de obter uma micrografia eletrônica da primeira seção em uma das posições predeterminadas, software TEM seção Serial (parte do pacote de software fornecido com nosso microscópio de elétron) move-se para o ponto correspondente na segunda seção, a fim de obter uma micrografia eletrônica da localização correspondente. Isto é repetido para cada localização na grade pré-determinada. Em nossa abordagem, um disector é usado para contar o número de partículas em cada par de elétron-micrografias8,9. Um disector consiste em um par de quadros contando, uma para cada seção8,9. A densidade numérica de objetos é determinada por apenas contando objetos visíveis na primeira seção (ou seção de referência), mas não na segunda seção (ou seção de pesquisa). Isto permite estimar a densidade numérica de objetos em uma maneira rápida e eficiente de8,9. Além em seções única, bidimensionais características estruturais podem ser medidas.
Nós aplicamos este fluxo de trabalho com sucesso para avaliar as diferenças em números de sinapse no hipocampo de ratos expostos ao ambiente enriquecido (EE) em relação ao ambiente padrão (SE) habitação condições4,5, de condições de alojamento e também para avaliar as diferenças ultraestrutural entre ratos de tipo selvagem (WT) e o neuropeptídeo Y (NPY) KO ratos mantidos sob SE e EE5. Nosso objetivo foi olhar especificamente para as características estruturais dos neurônios, tais como a densidade sináptica numérica, os comprimentos da zona activa em cortes transversais e da densidade pós-sináptica, a largura da fenda sináptica e o número de vesículas sinápticas, a fim de avaliar as mudanças na conectividade neuronal e ativação entre as diferentes condições experimentais. Além disso, estávamos interessados na densidade numérica das vesículas densas-núcleo (DCV) em neurônios para determinar a quantidade de neuropeptídeos armazenados em uma determinada área do cérebro.
Baseado no sucesso da nossa abordagem para os estudos descritos acima, no nosso próximo passo, adaptámos o nosso fluxo de trabalho para selecionar áreas para análise elementar imparcial dentro de amostras de cérebro humano. Isto foi feito de ferro, imagem, que é armazenado em moléculas de ferritina em neurônios e células gliais. Por isso, compilamos um script que nos permitiu automatizar a maioria das operações para um processo de seleção aleatória de seções do cérebro em uma área definida.
O fluxo de trabalho apresentado aqui permite que o pesquisador obter dados sobre as características ultra-estruturais de forma imparcial. Isto é muito menos demorado do que as investigações de volume de seções seriais. Vários aplicativos diferentes são usados para atingir esse objetivo. Em primeiro lugar, nosso software feito sob medido do RPS (para detalhes sobre a disponibilidade, favor contatar o autor correspondente) é usado para introduzir um estágio aleatório-shift para selecionar as coordenadas da área de amostragem. Isto permite uma amostragem sistemática uniforme do ROI. Em seguida, para a contagem de estruturas específicas, adaptamos o método disector, onde 2 seções consecutivas com distância conhecida são comparadas, em uma forma nova, em comparação com anteriores estudos13,14,15 como usamos nossos feito por software RPS para amostragem aleatória uniforme sistemático. Isso economiza tempo em comparação com 3D-reconstruindo toda volumes das seções de seriais. O software feito sob medido do RPS é desenvolvido especificamente para um tipo de microscópio, que é um fator limitante para a reprodução de fluxo de trabalho. Uma alternativa deste software específico seria um aplicativo que permite a execução de scripts e é compatível com outros modelos de microscópio.
Com sucesso, usamos esta abordagem para nossos estudos comparativos4,5. Em seções ultra-finas de tecido neuronal, a área de interesse foi delineada e imagens foram tomadas por amostragem sistemática uniforme dentro desta área. Deve notar-se que a área de interesse, a camada de polimorfo de giro do pectínea, é uma área bastante pequena para investigar o que pode ser benéfico para a nossa abordagem. Dentro de um disector colocado aleatoriamente, foram avaliados o número de DCV e várias características ultra-estruturais de sinapses no DGpl de ratos adultos alojados em SE e EE, bem como adulto WT ratos contra ratos adultos de nocaute NPY. Usando nossa abordagem, os dados coletados mostraram alterações em alguns dos parâmetros investigados. Estes resultados confirmaram os de outros estudos semelhantes em animais juvenil2.
Uma desvantagem do uso experimental de fluxo de trabalho pode ser que esta abordagem multi-aplicação não é ideal em termos de facilidade de utilização, como os usuários precisam para se sentir confortável com interfaces de usuário diferentes (no nosso caso, a interface do usuário, TEM seção Serial o RPS software e software de SerialEM). Aprendendo a lidar com todos os aplicativos de maneira eficiente é demorado e deve ser levado em conta. No entanto, investir o tempo para aprender a usar este fluxo de trabalho ainda é claramente favorável ao longo do tempo que é necessário para analisar toda volumes com serial seção TEM. O método de usar uma disector colocado por amostragem sistemática uniforme na área de interesse é suficiente para apresentar dados fiáveis1 sem a necessidade de investigar uma quantidade elevada de seções/volume.
Para maximizar o resultado em nossos estudos, foi vital para cuidar durante a preparação da amostra, bem como a preservação do tecido e as estruturas não é apenas crucial para a avaliação das características estruturais, mas também para identificar a área de interesse sem ambiguidade. Um fator crucial e talvez outra desvantagem desse método, é que uma alta qualidade dos pares de seções ultra-finas é necessária: não deve haver furos ou rugas que cobrem a área sob investigação em qualquer das seções, e a espessura de corte deve ser mantida homogênea. O pesquisador tem que ser bem treinados em Ultramicrotomia. Também tem que ser tomado quando da imagem latente as seções na temperatura, como as seções são sensíveis aos danos do feixe de elétron e podem facilmente se rasgar. Além disso, é importante escolher o número de áreas de amostragem no ROI. Dependendo do objetivo experimental, a ampliação das micrografias da elétron deve ser definido cuidadosamente. Para nossas experiências especificamente, contando as sinapses no sistema nervoso central, 20 regiões de interesse em uma seção com a área de 30.25 µm2 são ótimos. É aconselhável treinar o pessoal bem em reconhecer as características em questão (no nosso caso as sinapses, características sinápticas e DCV) para obter resultados fiáveis. A fim de identificar as sinapses, as vesículas sinápticas devem ser identificáveis e isso requer uma resolução de pelo menos 10 nm. Por isso, uma ampliação de 5000 X foi ideal, mas deve notar-se que a ampliação depende de parâmetros de hardware, tais como o tipo e a posição das câmeras e precisaria ser adaptado para outros tipos de microscópio e/ou câmera. Também tem de se notar que o protocolo usa aplicativos específicos para um TEM e que os usuários com outros modelos tem que considerar as diferenças na configuração.
Acreditamos que nosso fluxo de trabalho pode ser adaptado para muitas outras aplicações, não só em neurociência, mas em um amplo campo de ciências biológicas e também a ciência de materiais (quando a alta resolução de um TEM é necessário) sempre que a questão de pesquisa exige um sistemático uniforme amostragem aleatória e a quantidade de amostras a analisar pede uma maneira eficiente de tempo de análise. Por exemplo, estamos atualmente interessados em Localizar lojas de ferro no cérebro humano. Por isso, recentemente nós adaptamos nosso fluxo de trabalho, para permitir a análise elementar de seções ultra-finas em áreas escolhidas aleatoriamente. A fim de minimizar o número de aplicativos que são necessários para o fluxo de trabalho, tivemos como objetivo aplicar usando o software de SerialEM só, porque pode ser programado para mover a fase pré-definir pontos que podem ser selecionados de forma aleatória. Nós criamos scripts personalizados para controlar a temperatura, com o objectivo de automatizando o fluxo de trabalho totalmente. Isto provou ser viável exceto a focagem automática no modo de imagem filtrado, que não deu resultado satisfatório. Assim, usamos software de DM para focar e para a obtenção de imagens energia filtrada.
Em resumo, apresentamos soluções de software que ajudam na obtenção de micrografias de elétron de uma forma imparcial.
The authors have nothing to disclose.
Financiado pelo número de projeto de fundo de ciência austríaco, FWF, P 29370 B27
Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |