Se introduce un nuevo flujo de trabajo para investigaciones de microscopia electrónica del tejido de cerebro. El método permite al usuario examinar características neuronales de una manera imparcial. Para el análisis elemental, también presentamos un script que automatiza la mayor parte del flujo de trabajo para el muestreo al azar.
Las investigaciones de las características ultraestructurales de las neuronas y sus sinapsis sólo son posibles con microscopia electrónica. Especialmente para estudios comparativos de los cambios en las densidades y distribuciones de tales características, un protocolo de muestreo imparcial es vital para obtener resultados fiables. Presentamos un flujo de trabajo para la adquisición de imágenes de muestras de cerebro. El flujo de trabajo permite sistemático muestreo aleatorio uniforme dentro de una región definida del cerebro y las imágenes pueden ser analizadas utilizando un disector. Esta técnica es mucho más rápida que una examinación extensa de las secciones seriales pero aún presenta un enfoque factible para estimar las densidades y distribuciones de características ultraestructura. Antes de incrustar, secciones manchadas vibratome fueron utilizadas como referencia para identificar la región del cerebro bajo investigación, proceso que ayudó a acelerar la preparación de la muestra total. Este acercamiento fue utilizado para estudios comparativos investigando el efecto de un ambiente enriquecido de vivienda en varios parámetros ultraestructurales en el cerebro de ratón. Basado en el uso acertado del flujo de trabajo, adaptado a los efectos de análisis elemental de muestras de cerebro. Hemos optimizado el protocolo en el momento de la interacción del usuario. Automatizar todos los pasos lentos al compilar una secuencia de comandos para el software de código abierto SerialEM ayuda al usuario a centrarse en el trabajo principal de la adquisición de los mapas elementales. Como en el flujo de trabajo original, hemos prestado atención al enfoque de muestreo imparcial para garantizar resultados confiables.
En microscopia electrónica, es a menudo desafiante a regiones representativas dentro de las secciones de la muestra. Nosotros, como observador, estamos a menudo sesgadas para examinar regiones específicas señala a nuestra atención por las características llamativas de la muestra, impidiendo una muestra imparcial, bien distribuida. Sesgo de muestreo sólo puede ser evitada si cada parte de la región de interés es la misma probabilidad de acabar en una micrografía electrónica1. Es posible evitar el sesgo de muestreo sin una solución de software, por ejemplo, presionando el trackball del microscopio manualmente sin mirar la imagen, con el fin de seleccionar las regiones de muestreo donde se detiene la etapa. Pero estrictamente hablando, esto no es un procedimiento al azar, porque, consciente o inconscientemente, el usuario puede tener una influencia en el movimiento de la etapa, y, además, no es una manera sofisticada de selección de regiones de muestreo. Muestreo al azar se vuelve especialmente importante si pares de secciones se utilizan para determinar el número de estructuras en un volumen determinado, por ejemplo, estereología1, que requiere pares de secciones, una distancia conocida. También sería posible sólo en una sola sección y estimar el número de estructuras específicas2, pero con este enfoque los investigadores tienden a sobreestimar la densidad numérica de estructuras más grandes, a menos que las estructuras son muy pequeñas en comparación con el espesor de la sección. Enfoques alternativos son reconstruir volúmenes de tejido a partir de secciones seriadas y así obtener los datos deseados3. Pero esto es muy tiempo consumiendo y no un enfoque factible para estudios comparativos (más grandes).
Para superar estos problemas, hemos desarrollado un flujo de trabajo que permite al investigador seleccionar automáticamente las muestras para la obtención de micrografías electrónicas en el espaciamiento regular en secciones muy finas. La posición de los micrográfos de electrón es aleatoria, lo que permite el muestreo imparcial. El enfoque es adecuado tanto para la determinación de la densidad numérica de estructuras (por ejemplo, el sinapsis dentro de un cierto neuropil volumen4,5) y las dimensiones de características estructurales (por ejemplo, la anchura de la hendidura sináptica, o el diámetro de la densidad postsináptica4,5).
El flujo de trabajo usa un punto al azar por encargo (RPS) software (escrito en Java script mediante Scripting software suministrado con el microscopio) que calcula automáticamente las posiciones en la parrilla dentro de una región predefinida de interés en un ultra finos de la sección de muestreo. El software RPS mueve la etapa del microscopio electrónico a estos puntos predefinidos, de modo que una micrografía electrónica se puede hacer en cada momento. En primer lugar, el usuario define una región de interés dentro de la sección delgada. A continuación, el software RPS calcula posiciones en la parrilla dentro de esta región. El x / y coordenadas de la primera posición se crean al azar, y los restantes puestos se colocan en intervalos regulares de la red con respecto a la primera posición. Porque cada parte de la región de interés tiene la misma probabilidad de ser examinado, esto permite recolección de datos mínima. Este enfoque de muestreo también se le llama muestreo aleatorio uniforme sistemático (ver referencia6,7 para más detalles).
Para la determinación de la densidad numérica de estructuras, trabajamos con pares de secciones que están a una distancia conocida. Después de obtener un micrográfo de electrón de la primera sección en una de las posiciones predeterminadas, software sección serie TEM (parte del paquete de software suministrado con el microscopio electrónico) se mueve hasta el punto correspondiente a la segunda sección, a fin de obtener una micrografía electrónica de la ubicación correspondiente. Esto se repite para cada localización en la red predeterminada. En nuestro enfoque, un disector se utiliza para contar el número de partículas en cada par de micrográfos de electrón de8,9. Un disector consiste en un par de cuenta marcos, uno para cada sección8,9. La densidad numérica de los objetos está determinada por solamente contar objetos visibles en la primera sección (o sección de referencia) pero no en la segunda sección (o sección de búsqueda). Esto permite para estimar la densidad numérica de los objetos de una manera rápida y eficiente8,9. Además en cada sección, se pueden medir dos dimensiones características estructurales.
Hemos aplicado este flujo de trabajo con éxito para evaluar las diferencias en el número de sinapsis en el hipocampo de ratones expuestos a ambiente enriquecido (EE) en comparación con el entorno estándar (SE) vivienda condiciones4,5, de las condiciones de vivienda y también evaluar las diferencias ultraestructurales entre ratones de tipo salvaje (WT) y neuropéptido Y (NPY) KO ratones SE y EE5. Nuestro objetivo era mirar específicamente características estructurales de las neuronas, como la densidad sináptica numérica, la longitud de la zona activa en cortes transversales y de la densidad postsináptica, la anchura de la hendidura sináptica y el número de vesículas sinápticas, con el fin de evaluar los cambios en la conectividad neuronal y la activación entre las diferentes condiciones experimentales. Además, nos interesó la densidad numérica de vesículas de núcleo denso (DCV) en las neuronas para determinar la cantidad de neuropéptidos almacenado en cierta área del cerebro.
El éxito de nuestro enfoque de los estudios descritos anteriormente, en nuestro siguiente paso, hemos adaptado nuestro flujo de trabajo para seleccionar áreas para imparciales análisis elementales en muestras de cerebro humano. Esto se hizo al hierro de la imagen, que se almacena en moléculas de ferritina en neuronas y células gliales. Para ello, compilamos un script que nos ha permitido automatizar la mayoría de las operaciones de un proceso de selección al azar de secciones del cerebro en un área definida.
El flujo de trabajo que presentamos permite al investigador obtener datos sobre las características ultraestructurales de una manera imparcial. Esto es mucho menos tiempo que las investigaciones volumen de secciones seriadas. Se utilizan varias aplicaciones diferentes para lograr este objetivo. Al principio, nuestro software RPS por encargo (para información sobre disponibilidad, póngase en contacto con el autor correspondiente) se utiliza para introducir un cambio de escenario aleatorio para seleccionar las coordenadas del área de muestreo. Esto permite un muestreo al azar uniforme sistemático del ROI. A continuación, para el conteo de estructuras específicas, adaptamos el método disector, donde se comparan 2 secciones consecutivas con distancia conocida, de una forma novedosa en comparación con anteriores estudios13,14,15 como nuestro software por encargo de RPS para sistemático muestreo aleatorio uniforme. Esto ahorra tiempo en comparación con los volúmenes todos reconstrucción 3D de secciones seriadas. El software a la medida de la RPS ha sido desarrollado específicamente para un tipo de microscopio que es un factor limitante para el flujo de trabajo de la reproducción. Una alternativa de este software específico sería una aplicación que permite secuencias de comandos y es compatible con otros modelos de microscopio.
Hemos utilizado con éxito este enfoque para nuestros estudios comparativos4,5. El ultra delgadas secciones de tejido neuronal, el área de interés fue esbozado e imágenes fueron tomadas por muestreo aleatorio uniforme sistemático dentro de esta área. Debe ser observado que el área de interés, la capa polimorfa del giro dentado, es un área más bien pequeña para investigar que podría ser beneficioso para nuestro enfoque. Dentro de un disector colocada al azar, se evaluó el número de DCV y varias características ultraestructurales de las sinapsis en la DGpl de ratones adultos en SE y EE como WT adultos ratones versus adultos ratones knockout NPY. Con nuestro enfoque, los datos obtenidos demostraron cambios en algunos de los parámetros investigados. Estos resultados confirman los de otros estudios similares en animales menores2.
Un inconveniente de la utilización experimental de este flujo de trabajo puede ser que este multi-uso-enfoque no es ideal en términos de facilidad de uso, los usuarios necesitan para sentirse cómodo con diferentes interfaces de usuario (en nuestro caso, la interfaz de usuario, sección serie TEM el software RPS y SerialEM). Aprender a manejar todas las aplicaciones de manera eficiente consume tiempo y debe tenerse en cuenta. Sin embargo, invertir tiempo en aprender a usar este flujo de trabajo sigue siendo claramente favorable sobre el tiempo necesario para analizar los volúmenes enteros con sección serie TEM. El método de usar un disector de sistemático muestreo aleatorio uniforme en el área de interés es suficiente para presentar datos fiables1 sin la necesidad de investigar una gran cantidad de secciones/volumen.
Para maximizar los resultados en nuestros estudios, es indispensable tomar buen cuidado durante la preparación de la muestra, como la preservación de los tejidos y las estructuras no sólo es crucial para la evaluación de características estructurales, sino también para identificar claramente el área de interés. Un factor fundamental y quizás otro inconveniente de este método, es que una alta calidad de los pares de secciones muy delgadas se requiere: no debe existir huecos ni arrugas que cubren el área de investigación en cualquiera de las secciones, y el espesor de la sección debe ser mantener homogéneo. El investigador tiene que estar bien entrenado en ultramicrotomía. Cuidado debe también ser cuando proyección de imagen las secciones en la TEM, como las secciones son sensibles a daño de viga del electrón y pueden desgarrar fácilmente. Además, es importante elegir el número adecuado de áreas de muestreo en el ROI. Dependiendo el objetivo experimental, el aumento de los micrográfos de electrón debe ajustarse cuidadosamente. Para nuestros experimentos específicamente, contando las sinapsis en el sistema nervioso central, 20 regiones de interés en una sección con la superficie de 30,25 μm2 son óptimas. Se aconseja capacitar al personal también en el reconocimiento de las características en cuestión (en nuestro caso sinapsis, sinápticas características y DCV) para obtener resultados fiables. Con el fin de identificar las sinapsis, las vesículas sinápticas deben ser identificables y esto requiere una resolución de al menos 10 nm. Para ello, un aumento de 5000 X era óptimo, pero debe tenerse en cuenta que la ampliación depende de parámetros del hardware tales como el tipo y la posición de las cámaras y tendría que ser adaptado para otros tipos de microscopio y cámara. También tiene que tenerse en cuenta que el protocolo utiliza aplicaciones específicas para un TEM y que los usuarios con otros modelos a tener en cuenta las diferencias en la configuración.
Creemos que nuestro flujo de trabajo puede ser adaptado para otras muchas aplicaciones no sólo en Neurociencias sino en un amplio campo de las ciencias biológicas y Ciencias de materiales (cuando es necesaria la alta resolución de un TEM) siempre que la pregunta de investigación exige una sistemática uniforme muestreo aleatorio y la cantidad de muestras a ser examinadas pide de una manera eficiente de tiempo de análisis. Por ejemplo, estamos actualmente interesados en localizar tiendas de hierro en el cerebro humano. Para ello, recientemente hemos adaptado nuestro flujo de trabajo, para permitir análisis elemental en ultra delgadas secciones de áreas seleccionadas al azar. Para reducir al mínimo el número de aplicaciones que son necesarias para el flujo de trabajo, se intentó aplicar usando el software SerialEM, porque puede ser programado para mover el escenario para establecer los puntos que pueden ser seleccionadas de manera aleatoria. Hemos creado scripts personalizados para controlar la temperatura, con el objetivo de automatizar el flujo de trabajo completamente. Esto resultó posible excepto el enfoque automático en modo imagen filtrado, que no dió resultados satisfactorios. Así utilizamos software de DM para enfocar y para la obtención de las imágenes filtradas de energía.
En Resumen, presentamos soluciones de software que ayudan en la obtención de micrografías electrónicas de una manera imparcial.
The authors have nothing to disclose.
Financiado por el número de proyectos del fondo de Ciencias austríaca, FWF, P 29370 B27
Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |