艰难梭菌(p) pppp 合成酶的纯化及体外活性测定
概要
本文介绍了一种纯化带组氨酸标记的热释蛋白酶的方法, 并利用放射性标记底物和产物的薄层色谱法测定了体外的酶活性。酶活性测定广泛适用于任何激酶、核苷酸循环酶或磷转移反应, 其机理包括三磷酸核苷酸水解。
Abstract
激酶和焦磷酸激酶酶将磷酸伽玛或β-焦磷酸钙基团从三磷酸核苷酸前体转移到底物, 以产生磷酸化产物。使用γ-32-p标记的 ntp 前体可以通过射线成像同时监测基板的利用率和产品的形成。纤维素板上的薄层色谱 (tlc) 允许对底物和产品进行快速分离和敏感定量。我们提出了一种利用薄层色谱法测定纯化 (p) pppp 合成酶的热磷酸酶活性的方法。这种方法以前曾被用来表征循环核苷酸和二核苷酸合成酶的活性, 广泛适用于表征水解三磷酸核苷酸键或转移末端的任何酶的活性磷酸盐从磷酸盐供体到另一个分子。
Introduction
激酶和焦磷酸激酶 (或二磷酸激酶) 酶将磷酸酯从三磷酸核苷酸 (ntp) 前体转移到底物分子。底物可以包括其他核苷酸、氨基酸或蛋白质、碳水化合物和脂质1。生物信息学分析有时可以根据与表征酶的相似性预测酶的同源基底物或底物, 但实验验证仍然是必要的。同样, 必须通过实验确定酶对底物的亲和力及其催化磷转移反应的速度, 以及共同因素、抑制剂或其他酶效应的影响。为了避免细菌细胞质中其他消耗 atp 的酶消耗 atp 前体的消耗, 定量活性检测需要纯化的蛋白质。
用金属亲和层析纯化蛋白质已在文献2,3中得到了深入的报道。组氨酸标记由六个连续的组氨酸残基附加到重组蛋白的 n-或 c 末端允许通过金属亲和层析 4,5,6快速纯化。这些序列与它们修饰的蛋白质相比很小, 通常对蛋白质功能的影响很小, 尽管它们有时会改变蛋白质的稳定性和/或酶动力学7,8.同一蛋白质的 n-和 c 端部的组氨酸标记可以产生不同的效果, 如果不知道所涉及的蛋白质的结构, 就很难预测。组氨酸标记通常是在重组蛋白克隆过程中采用的, 方法是设计编码6个组氨酸残基的引物, 或者立即 3 ‘ 到 atg 启动密码子, 或者立即 5 ‘ 到开放阅读框架的停止密码子。扩增后, 含有六分苷的基因在诱导启动子的控制下被连接成载体并表达, 通常是在大肠杆菌的实验室菌株中表达的。然后, 重组蛋白可以在含有固定化二价阳离子 (通常是镍或钴)的亲和树脂上分离9。用咪唑滴定法可以去除污染原生金属结合蛋白, 从而有竞争力地取代结合蛋白2。最后, 目标蛋白从浓度较高的咪唑柱中洗脱。固定化金属阳离子树脂有多种商业来源, 制造商为缓冲条件和咪唑浓度提供建议。洗脱后, 蛋白质可通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sds-page) 进行分析, 进行透析, 或立即用于功能分析。
有几种方法可以通过将 atp 磷酸盐键水解与释放或激发荧光或产生化学发光的第二反应相结合来间接监测激酶活性, 但这些反应具有多个运动部件, 并且可以是后勤上具有挑战性10。专门测量磷转移活性的最直接方法是直接监测放射性标记磷酸盐基团从市售的γ-32-pntp 前体转移到非放射性标记基板 11的情况,12,13. 放射性标记基板和产品的混合物可以用薄层色谱法 (tlc) 进行分离和定量。薄层色谱利用溶质在给定溶剂中的不同流动性, 允许溶剂 (液相) 通过毛细管作用在表面 (固相) 上迁移, 在表面上吸附了溶质混合物14。与分子量较高或与固体有很大亲和力的溶质相比, 小的溶质与与固相缺乏良好的相互作用, 它们的迁移距离将更长。为了检测磷的转移, 磷酸盐分子增加了分子的分子量, 并在中性或酸性 ph 值11,12,14时添加负离子电荷。这降低了它们在基本表面 (如 pei-纤维素) 上的流动性。在酸性磷酸钾缓冲液中开发时, 单、二、三、四、五磷酸五甲酸盐的混合物可以在 pei 纤维素上很容易分离, 从而能够对每个物种进行定量 (图 2, 图 3)。这种检测可以使用含有感兴趣酶的细胞裂解物进行, 但这包括其他激酶、磷酸酶和一般 atpase 的活性耗尽底物和/或产品的可能性。为了对酶活性进行体外定量评估, 有必要对感兴趣的酶进行纯化。
鸟苷四磷酸酯 (ppgpp) 和 guanosine pentapph0fate (pppgpp) 是由焦磷酸基团从三磷酸腺苷 (atp) 前体转移到磷酸 guanosine (gdp) 或鸟苷四磷酸酯 (gtp) 基板15。这些单一的核糖核酸信号, 统称为 (p) ppgpp, 介导了细胞范围内对环境压力的反应, 被称为在不同细菌物种15,16的严格反应。两类保守的酶催化 (p) ppgpp15、17 Rel/Spo homolog (rsh) 酶的形成, 是 “长” 双功能 (p) ppgpp synthaseasepaseasep 水解酶, 其命名与 rela 和 spot (p) ppgpp 代谢相似大肠杆菌中含有合成酶、水解酶和调节域的酶, 而小的 alarmone 合成酶 (sas) 酶是短的单功能合成酶, 专门存在于 gram 阳性菌15中,17,18. 形成孢子的革兰氏阳性细菌艰难梭菌编码假定 rsh 和 sas 基因19。在这里, 我们提出的初始活性检测, 证实艰难梭菌rsh 酶是一种催化活性 (p) ppgpp 合成酶。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文报道了艰难梭菌中 hs 标记 rsh 的纯化过程, 并提出了一种利用放射性标记薄层色谱法进行活性定量的方法。这种方法以前曾被用来评估艰难梭菌的二瓜酸环化酶的活性, 以及来自其他生物体的 ppgpp 合成酶、核苷酸循环酶、激酶和磷酸二酯酶的活性11,12 ,13,21。虽然这种方法并不新颖, 但…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由 niaid 1k22ai118929-01 资助。ebp 得到了美国弗吉尼亚州诺福克郡老多米尼翁大学研究办公室的暑期研究研究金计划赠款的支持。
Materials
| Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
| PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | – | |
| Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | – | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | – | |
| Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
| Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 um thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | – |
参考文献
- Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags. Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
- Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
- Booth, W. T., et al. Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability. ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).
- Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics. 生化学. 50 (25), 5799-5805 (2011).
- Chaga, G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).
- Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization. Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).
- Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase. Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).
- Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile. Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).
- Purcell, E. B., Tamayo, R. Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).
- Ross, P., et al. Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase. Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).
- Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical?. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
- Boutte, C. C., Crosson, S. Bacterial lifestyle shapes stringent response activation. Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).
- Nanamiya, H., et al. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).
- Gaca, A. O., et al. Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response. mBio. 4 (5), (2013).
- Sebaihia, M., et al. The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome. Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).
- Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
- Purcell, E. B., et al. A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase. Infection and Immunity. , (2017).
- Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis. Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).
- Bartlett, J. G. Clostridium difficile: progress and challenges. Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).
- . . US Department of Health and Human Services. , (2013).
