概要

Bioaerosols 음이온 교환 수 지를 사용 하 여 바이러스의 검출

Published: August 22, 2018
doi:

概要

음이온 교환 수 지 기반 방법, 바이러스의 충돌-기반 bioaerosol 샘플링 시연 액체에 적응 합니다. 다운스트림 분자 탐지와 결합 하면 메서드 bioaerosols에서 바이러스의 손쉬운 및 민감한 감지.

Abstract

이 프로토콜에서는 바이러스에 대 한 사용자 지정된 bioaerosol 샘플링 방법을 보여 줍니다. 이 시스템에서는, 음이온 교환 수 지에서 bioaerosols 부정 청구 바이러스의 효능 농도 액체 치는 행위 기반 공기 샘플링 디바이스와 결합 이다. 따라서, 수 지 bioaerosol 샘플링 워크플로에 추가 농도 단계 역할을 합니다. 바이러스 성 입자의 핵 산 추출 다음 결과 샘플 분자 분석에 대 한 적합 한 음이온 교환 수 지에서 직접 수행 됩니다. 또한,이 프로토콜 사용자 bioaerosol 챔버 다양 한 환경 조건과 환경 변수 온도, 습도, 등의 지속적인 모니터링에 대 한 허용 아래 바이러스 라덴 bioaerosols 생성할 수 설명 바람 속도, 고 졸 대량 농도입니다. 이 프로토콜을 사용 하 여의 주요 장점은 수정 되지 않은 기존의 액체 임 핀 저를 직접 비교를 통해 평가 바이러스 탐지의 감도 증가입니다. 다른 장점은 집중 다양 한 부정 청구 바이러스, 음이온 교환 수 지 (샘플 당 ~$0.14), 및 사용의 용이성의 저렴 한 비용을 포함 합니다. 단점 수 지 흡착 바이러스 성 입자의 infectivity 평가이 프로토콜의 무 능력을 포함 하 고 액체 샘플링 버퍼의 최적화에 대 한 필요는 임 핀 저 내에서 사용 하는 잠재적으로.

Introduction

이 방법의 목적은 bioaerosols에서 부정 청구 바이러스의 분자 탐지를 촉진 하기 위하여 매우 중요 한 bioaerosol 샘플링 플랫폼을 제공. 미생물, 바이러스 성 입자를 포함 하 여 장시간 시간1bioaerosols에서 살아남을 수 있습니다. Bioaerosols 비교적 긴 거리를 여행 하 고 생존 및 infectivity, 산업 영향 받은 개인에서 6 킬로미터의 거리에 있는 타워에서 Legionnaires’ 질병의 발발에 의해 입증으로 유지 수 및 18 사망자2결과. 간접 전송 bioaerosols 중재 하는 인 간에 게 바이러스의 여러 설정에서 발생할 수 있으며 학교와 레스토랑3,4노로바이러스 감염에 대 한 입증 되었습니다. 바이러스의 bioaerosol 전송의 생산 시설5, 바이러스의 운동에 주요 요인으로 간주 되 고이 전송 경로와 마찬가지로, 돼지 및 가금류 농장에서와 같은 농업 설정에서 발생할 수 있습니다. 6 , 7 , 8 , 9.

시위는 H5 독감 바이러스는 살아있는 동물에서 bioaerosols에서 발견 된 중국에서 시장 에서처럼 바이러스 라덴 bioaerosols의 효과적인 샘플링 신속한 진단 및 확산 방지를 위한 대비에 개선을 위한 수 고는 미국10,11. 현재 bioaerosol 샘플링 기술을 다른 입자 캡처 원칙의 숫자를 포함 하 고 impingers, 사이 클론, impactors, 및 필터12에 광범위 하 게 분류 될 수 있다. 그것은 철저 하 게 모든 장점을 커버 하이 프로토콜의 범위와 bioaerosols;에서 바이러스의 샘플링에 대 한 이러한 플랫폼의 단점 그러나, 그것은 바이러스 및 살 균 소13의 컬렉션에 대 한 이러한 샘플링 장치의 대다수는 최적화 되지 진술 될 수 있다. 또한, 바이러스 성 입자의 infectivity은 종종 부정적인 영향을, 액체 impingers 바이러스 infectivity 샘플링 장치 고체 impactors 또는 필터14보다 더 효과적으로 유지 하는 것으로 간주와 함께. 그러나, 하나의 액체 충돌의 단점은 대상 희석 효과, 바이러스는 비교적 많은 양의 (일반적으로 ≥20 mL) 액체 수집 용기에 수집 때문에 발생 합니다. 또 다른 중요 한 단점은 집중 입자를 액체 impingers의 차선의 효율성 포함 < 0.5 µ M 크기15. 그러나, 이러한 장치의 캡처 효율 immobilization 바이러스 성 핵 산 바이러스 infectivity16,17의 보존을 향상 시킬 수 있습니다으로 고체 행렬에 동원 정지에 의해 개선할 수 있습니다.

우리는 이전 음이온 교환 수 지 캡처 및 F-RNA 살 균 소, A 형 간염 바이러스, 인간 아 데 노비 루스, 고로18,19 포함 하 여 액체 매트릭스에서 바이러스의 농도 대 한 효과적인 도구입니다 증명 하고있다 ,20. 제조 업체에 의해 정의 된 대로이 작품에서 음이온 교환 수 지는 기능성된 4 급 아민 그룹 중재 하십시오 매력 및 액체 매체21 에서 음이온의 캡처 macroreticular 폴리스 티 렌 강한 기본 음이온 교환 수 지 . 따라서, 음이온 교환 수 지 그물 네거티브 표면 요금, 많은 장 바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 다른 바이러스 관련 공공 및 동물 건강을 포함 하 여 바이러스를 캡처 예정 이다.

현재 프로토콜 액체 임 핀 저를 음이온 교환 수 지의 추가 포함 한다. 이 시스템에서 수 지 임 핀 저 액체에서 바이러스 성 입자에 대 한 보조 농도 단계 역할을 합니다. 핵 산 분자 분석에 대 한 집중된 샘플을 제공 하는 작은 볼륨에서 직접 eluted 수 다음. 따라서,이 방법의 주요 장점은 주로 샘플 볼륨 감소를 통해 바이러스 검출 감도에 개선 이다. 또한, 때문에 부정적인 충전 바이러스의 고유의 일반적인 캡처, 방법은 가능성이 많은 관심의 바이러스의 탐지를 위해 적용 가능한. 여기, 메서드는 백신 긴장의 유형 A와 B 형 인플루엔자 바이러스와 FRNA coliphage MS2 (MS2)에 대 한 보여 줍니다. 이러한 바이러스 그 후 앞에서 설명한22로 표준 qRT-PCR 분석 실험을 사용 하 여 검색 됩니다. 끝점 사용자 때문에이 메서드를 수행에 문제가 발생할 것을 기대 하지 해야 수정 현재 기존 장비 bioaerosol 샘플링 및 분석의 기존 흐름에 주요 중단을 구성 하지 않습니다.

Protocol

1. Bioaerosol 챔버의 설치 ( 그림 2참조) 사전에 0.01 M 버퍼링 인산 염 분, pH 7.5 (PBS)의 20 mL와 함께 액체 impingers 로드 합니다. 음이온 교환 수 지의 0.5 g을 추가 하 고 컨트롤 역할을 수행 하는 다른 액체 임 핀 저와 액체 impingers 중의 PBS 내 일시 중단. 챔버 내부에 bioaerosol는 분무기를 직면 하는 어로 졸 후미와 클램프 스탠드를 사용 하 ?…

Representative Results

그림 1 에서 bioaerosols 액체 기반의 impingers 수 지의 포함을 통해 바이러스의 차지 기반 캡처의 뒤에 원리를 보여 줍니다. 그림 2 는 사용자 bioaerosol 챔버의 설치. 그림 3 에서는 aerosolization 실험 및 측정 품질 관리를 보장 하기 위해 설정에 관련 된 단계를 설명 합니다. 그림 4 는 qRT-PCR bio…

Discussion

이 프로토콜에서 bioaerosols 수정된 액체 impingers를 사용 하 여 민감한 바이러스 캡처 하는 방법을 설명 합니다. 방법은 탐지 및 정량화 bioaerosols에 바이러스 부하의 최적화 되어 있습니다. 여기 설명 하는 특정 수정 일반적인 액체 임 핀 저 안에 포함 된 액체에 음이온 교환 수 지의 추가 포함 한다. 이 메서드는 원심 분리, 여과, 강 수 기반 방법 등 다른 샘플 처리 기술 이러한 이점을 제공 하지 않는 ?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 농업 건강과 안전 (5U54OH008085)에 대 한 CDC/NIOSH 높은 평야 Intermountain 센터와 콜로라도 생명 과학 발견 평가 그랜트 프로그램 (14BGF-16)에서 자금에 의해 지원 되었다.

Materials

Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) American Type Culture Collection ATCC 15597-B1
FluMist Quadrivalent AstraZeneca Contact manufacturer Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855195
Primers and probes Integrated DNA Technologies NA
0.2 µM sterile filter NA NA
1 L pyrex bottles or equivalent NA NA
1 mL pipet tips NA NA
1 mL pipettor NA NA
50 mL serological pipet NA NA
PCR tubes NA NA
Pipet-aid or equivalent NA NA
QIAamp Viral RNA Mini Kit Qiagen 52904
QuantiTect Probe RT-PCR Kit Qiagen 204443
Amberlite IRA-900 chloride form Sigma-Aldrich 216585-500G
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P5368-10PAK
Water (molecular biology grade) Sigma-Aldrich W4502-1L
Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher 13-698-791
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes  ThermoFisher 14-432-22
Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes ThermoFisher 05-538-62
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX ThermoFisher 11745100
SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set SKC Inc. 225-9593
Vac-u-Go sample pumps SKC Inc. 228-9695
Collison nebulizer (6-jet) BGI Inc. NA
HEPA capsule PALL 12144
Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 TSI Inc. NA
Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A TSI Inc. NA
SidePak AM510 personal aerosol monitor TSI Inc. NA
Bioaerosol chamber NA NA

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記事を引用
Schaeffer, J. W., Chandler, J. C., Davidson, M., Magzamen, S. L., Pérez-Méndez, A., Reynolds, S. J., Goodridge, L. D., Volckens, J., Franklin, A. B., Shriner, S. A., Bisha, B. Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin. J. Vis. Exp. (138), e58111, doi:10.3791/58111 (2018).

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