Мы представляем собой протокол для строительства тиоэфиры/Винил сульфид привязанный винтовой пептиды с помощью фото индуцированной тиоловых СВ/тиоловых yne hydrothiolation.
Здесь мы описываем подробный протокол для подготовки привязал тиоэфиры пептиды, используя на смолы внутримолекулярной/межмолекулярных тиоловых Ен hydrothiolation. Кроме того этот протокол описывает подготовку Винил сульфид привязанный пептиды, используя в решение внутримолекулярной тиоловых yne hydrothiolation между amino acids, которые обладают алкен/алкины боковых цепей и остатков цистеина в я, я + 4 позиции. Линейные пептиды были синтезированы, с использованием стандарта на основе Fmoc пептид Твердофазный синтез (ППУ). Тиоловых Эне hydrothiolation осуществляется с использованием внутримолекулярного Тио-реакций или межмолекулярных Тио Эне реакции, в зависимости от длины пептида. В этом исследовании реакция внутримолекулярной Тио Эне осуществляется в случае коротких пептидов, используя на смолы deprotection групп trityl остатков цистеина, после полный синтез линейных пептид. Смола затем устанавливается с помощью фотоинициатора 4-methoxyacetophenone (карта) и 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (СПП) УФ-облучения. Реакции межмолекулярной тиоловых Эне осуществляется путем растворения Fmoc-КМС-OH в N, N– диметилформамид (DMF) растворителя. Это затем реагирует с пептида, используя остатки алкен подшипник на смоле. После этого macrolactamization осуществляется с помощью Гексафторофосфат Бензотриазол-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt) и 4-Methylmorpholine (НММ) как Активация реагентов на смолы. После macrolactamization, продолжал пептидного синтеза с использованием стандартных ППУ. В случае Тио yne hydrothiolation линейной пептид расщепляется из смолы, сушеные и впоследствии распущен в дегазации ДМФ. Это затем облученных, с использованием ультрафиолетового света с фотоинициатора 2,2-диметокси-2-phenylacetophenone (ДМПА). После реакции ДМФ испаряется и сырой осадок осаждается и очищается с помощью высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Эти методы могут функционировать для упрощения поколения привязал тиоэфиры циклические пептиды благодаря использованию химии Тио СВ/yne нажмите кнопку, которая обладает превосходной функциональной группы терпимости и хороший урожай. Введение тиоэфиры облигаций в пептиды использует преимущества природы нуклеофильных остатков цистеина и окислительно-инертен по отношению к дисульфидными облигаций.
Разработка лигандов для модуляции белок белковых взаимодействий (ИЦП) обеспечивает привлекательный подход для современных лекарственных препаратов. Таким образом много усилий было вложено в изучение Роман химических методов, которые могут эффективно модулировать ИЦП1,2,3. ИЦП обычно состоят из мелких, большой или прекращено взаимодействующих поверхностей, и малые молекулы, обычно считаются неподходящими лигандов для модуляции ИЦП4,5. С подходящим подвергаются взаимодействующих площадью поверхности короткие пептиды, которые имитируют структурные особенности белка интерфейсов представляют собой идеальные кандидаты для решения этой проблемы6,7. Однако короткие пептиды, обычно неструктурированные в водном растворе. Это связано с тем, что молекулы воды, которые конкурируют с сетью склеивание внутримолекулярных водородных пептид позвоночника и четко конформации entropically неблагоприятных в воды8. Кроме того пептиды имманентно низкой стабильности и проницаемость свойства ячейки во многом ограничить их использование в биологических приложений9,10. Согласно результатам анализа банка данных (PDB), белка > 50% ИЦП включать короткие α-спирали взаимодействия11. Таким образом различные химические методы были разработаны в отношении стабилизации спирали. К ним относятся дисульфида/тиоэфиры Бонд формирования12,13,14, кольцо закрытие метатеза15, лактамные кольцо формирования16, «щелкните «химия17, добавление perfluoroarenes18,19и винил сульфидные формирования20.
Стабилизированный винтовой пептиды, широко используются для различных внутриклеточных целей, в том числе p53, эстрогеновых рецепторов, РАН, BCL-2 семьи белки и другие21,,2223,24. ALRN-6924, все углеводородов прошит двойной ингибитор пептид MDM2 и MDMX, в настоящее время используется для клинического расследования25. В последние несколько лет наша группа сосредоточила внимание на разработке методов стабилизации Роман пептид с помощью тиоловых Эне тиоловых yne реакции26,,27и28. В общем мы продемонстрировали, что эти фото инициатором реакции эффективны в мягких условиях, когда естественно используется обильные цистеина. Кроме того мы показали, что эти реакции имеют отличные функциональные группы терпимость, био ортогональные и доказали быть применимым для пептидов и белков изменения29. Результате пептиды сульфид привязал тиоэфиры/Винил основном улучшения химического пространства ограничения пептиды, предоставляют центр лабильной модификации на трос и доказано, чтобы быть применимы для использования в многочисленных биологических приложений30 ,,31–32. На сегодняшний день, были описаны только ограниченное доклады относительно тиоловых СВ/тиоловых yne пептид циклизации. В исследовании, опубликованном в Anseth et al. в 2009 году на смолы внутримолекулярной тиоловых реакций для пептида циклизация между активированные алкенов с цистеином был показали33. В 2015 году Чжоу и др. описал двухкомпонентный радикальной начатый тиоловых реакций для пептида, сшивание34 и последующих, последовательные тиоловых yne/Восточный муфта реакции35. Недавно мы описали ряд работы на основе тиоэфиры/Винил сульфид привязал пептиды20,26,27. Этот протокол описывает подробный синтез пептидов сульфид привязал вышеупомянутых тиоэфиры/винил в надежде, что это будет полезно для более широкого исследовательского сообщества.
В на смолы внутримолекулярной Тио Эне циклизация, описанные на рис. 3удаление trityl группы остатков цистеина оказалась важным шагом для последующего фотореакционного. Кроме того низкомолекулярных пептидов до и после, что реакция оказалась идентичной как изображены на <str…
The authors have nothing to disclose.
Авторы признают финансовой поддержки от естественных наук Китая гранты фонда (№ 21372023, 21778009 и 81701818); Министерство науки и техники Китайской Народной Республики (№ 2015DFA31590); Шэньчжэнь науки и технологии инновации Комитет (No. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 и GJHS20170310093122365); и Китай Докторантура научный фонд (№ 2017 М 610704).
Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) | HECHENG | GRM50407 | |
Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem (Shanghai) Ltd. | ||
N-Methyl-2-pyrrolidinone | Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. | 3230 | skin harmful |
N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | skin harmful |
Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
N,N-Diisoproylethylamine | Aldrich | 9578 | irritant |
Trifluoroacetic acid | J&K | 101398 | corrosive |
Triisopropylsilane | J&K | 973821 | |
1,2-Ethanedithiol | J&K | 248897 | Stench |
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate | GL Biochem (Shanghai) Ltd. | 851012 | |
Morpholine | Aldrich | M109062 | irritant |
Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
Acetonitrile | Aldrich | 9758 | toxicity |
Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone | Energy | A050035 | |
4-methoxyacetophenone | Energy | A050098 | |
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone | Energy | D070132 | |
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) | J&K | 281281 | |
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate | Energy | E020172 | |
1-Hydroxybenzotriazole | Energy | D050256 | |
4-Methylmorpholine | Energy | W320038 | |
High Performance Liquid Chromatography | SHIMADZU | LC-30AD | |
Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU | LCMS-8030 | |
Lyophilizer | Labconco | FreeZone | |
SpeedVac concentration system | Thermo | Savant | |
vacuum manifold | promega | A7231 | |
three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
poly-prep chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 |