概要

Utilizando mediada por la transferasa Terminal dUTP Nick End-etiquetado (TUNEL) y caspasas 3/7 ensayos a muerte celular epidérmica, medida en ranas con la quitridiomicosis

Published: May 16, 2018
doi:

概要

Cuantificar la muerte celular epidérmica en ranas con quitridiomicosis usando dos métodos. En primer lugar, utilizamos terminal transferasa-mediated dUTP nick etiquetado final (TUNEL) en situ histología para determinar las diferencias entre animales clínicamente infectados y no infectados. En segundo lugar, llevamos a cabo un análisis de series temporales de la apoptosis sobre la infección usando un análisis de la proteína caspasa 3/7.

Abstract

Anfibios están experimentando una gran pérdida de biodiversidad a nivel mundial y una de las principales causas es la quitridiomicosis enfermedad infecciosa. Esta enfermedad es causada por el hongo patógeno Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), que infecta y afecta epidermis de rana; sin embargo, los cambios patológicos se han no explícitamente caracterizados. Apoptosis (muerte celular programada) puede utilizarse por los patógenos para dañar tejido anfitrión, pero también puede ser un mecanismo de host de resistencia a las enfermedades para la eliminación del patógeno. En este estudio, cuantificar la muerte de las células epidérmicas de los animales infectados y no infectados usando dos análisis diferentes: terminal transferasa-mediated dUTP nick end-etiquetado (TUNEL) y caspasas 3/7. Utilizando tejido de piel de muslo y ventral, dorsal, en el ensayo TUNEL, observamos muerte en las células epidérmicas en situ de los animales clínicamente infectados de la célula y comparar la muerte de la célula con los animales no infectados mediante microscopía fluorescente. Para determinar cómo cambian los niveles de apoptosis en la epidermis en el transcurso de la infección extraer muestras de la punta del dedo del pie quincenal durante un período de 8 semanas y utilizar un ensayo de caspasas 3/7 con proteínas extraídas para cuantificar la actividad dentro de las muestras. Entonces correlacionamos actividad de caspasas 3/7 con la carga de la infección. El ensayo TUNEL es útil para la localización de la muerte de la célula en situ, pero es costoso y el tiempo por muestra. El ensayo de caspasas 3/7 es eficaz para tamaños de muestra grandes y tiempo curso de experimentos. Sin embargo, porque las de biopsias punta del dedo del pie de rana son pequeñas hay extracto limitado disponible para estandarización de la muestra a través de métodos de cuantificación de la proteína, tales como el ensayo de Bradford. Por lo tanto, sugerimos estimar el área superficial de la piel a través del análisis fotográfico de las biopsias del dedo del pie para evitar el consumo de los extractos durante la normalización de la muestra.

Introduction

Anfibios están experimentando actualmente una las mayores pérdidas de la biodiversidad global de cualquier taxa vertebrados1. Una de las principales causas de estos descensos son la piel fatal enfermedad chytridiomycosis, causada por el hongo patógeno Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. El patógeno infecta superficialmente la epidermis, que puede conducir a la alteración de la función de la piel resultando en pérdida del electrólito grave, paro cardiaco y muerte3. Varios mecanismos inmunes del huésped potencial contra Bd actualmente se están estudiando, tales como péptidos antimicrobianos4,5, de la flora bacteriana cutánea6, inmune de la célula receptores7,8, y actividad de linfocitos9,10. Sin embargo, pocos estudios explorarán si epidérmica apoptosis y muerte celular es un mecanismo inmune contra este patógeno mortal.

Muerte celular, ya sea a través de la apoptosis (muerte celular programada) o necrosis (muerte), en la epidermis puede ser una patología de la infección de la Bd . La investigación anterior sugiere que Bd infección puede inducir apoptosis debido a la interrupción de uniones intracelulares se observa cuando los explantes de piel están expuestos a zoospora sobrenadantes en vitro11. Además, cambios degenerativos epidérmicos en Bd-ranas infectadas se observan con microscopia electrónica12,13. Análisis transcriptómico indican que las vías de apoptosis son upregulated en piel infectada14y esplenocitos de anfibios sufren apoptosis cuando son expuestos a Bd sobrenadantes en vitro15. A pesar del creciente volumen de evidencia que sugiere que el Bd puede inducir apoptosis y anfitrión célula muerte en vitro, estudios en vivo que explorar o cuantificar apoptosis carecen de mecanismos a través de la progresión de la infección. Además, se desconoce si el host utiliza apoptosis como una estrategia defensiva inmune para luchar contra la infección de la Bd , o si la apoptosis es una patología de la enfermedad.

En este estudio, el objetivo fue detectar muerte celular epidérmica y apoptosis en animales infectados en vivo usando dos métodos: Análisis de la proteína caspasa 3/7 y terminal transferasa-mediated dUTP nick etiquetado final (TUNEL) en situ ensayo. Como cada ensayo detecta diferentes aspectos de la muerte de la célula16, juntos estos métodos proporcionan un completo entendimiento de los mecanismos implicados en la muerte celular y aseguran una medida exacta del efecto. El ensayo de caspasas 3/7 cuantifica la actividad de las caspasas efectoras 3 y 7, que permite la cuantificación de ambos las vías intrínseca y extrínseca de la apoptosis. En contraste, el ensayo TUNEL detecta la fragmentación del ADN, que es causada por mecanismos de muerte celular incluyendo apoptosis, necrosis y pyroptosis17. Utilizamos el ensayo TUNEL para investigar la situación de muerte celular en la epidermis de los animales clínicamente infectados y no infectados con tres secciones de piel diferentes: el dorso, el vientre y el muslo de Pseudophryne corroboree. Este método identifica el sitio anatómico de la muerte de la célula, como distinguiendo su ubicación dentro de capas epidérmicas específicas. Entonces utilizamos el análisis de caspasas 3/7 para llevar a cabo una cuantificación de la serie de tiempo de la apoptosis a través de una infección de 8 semanas en Litoria verreauxii alpina. Tomar muestras de punta de dedo del pie quincenal de los mismos animales y son capaces de correlacionar la carga de infección del patógeno con la actividad de caspasas 3/7.

Protocol

Universidad James Cook aprobó ética animal en aplicaciones A1875 para p. corroboree y A1897 y A2171 L. v. alpina. 1. cría de animales y control de Animales de la casa individualmente, en un ambiente apropiado para la especie, con un agua apropiada, alimentación y limpieza horario. Revise diariamente los animales. Individuos adultos de la críticamente amenazada Pseudophryne corroboree (para el ensayo TUNEL, sección 4) y el amenazado Litoria…

Representative Results

Ensayo TUNEL Había más células positivas TUNEL en los animales infectados que en los animales control no infectado. La ubicación en situ de TUNEL positiva las células difieren en infectados y controlar animales. En animales control, hubo una distribución uniforme del TUNEL positiva las células a lo largo de la dérmica y epidérmica de la piel capas en niveles bajos (ver figura 1A</s…

Discussion

Exploramos epidérmico apoptosis y muerte celular como un mecanismo potencial de la patología de la quitridiomicosis enfermedad mortal o un mecanismo de resistencia a enfermedades en especies susceptibles de Bd . Se utilizaron dos métodos de evaluar la muerte celular en la epidermis, ensayo TUNEL en situ análisis de muerte celular epidérmica y caspasas 3/7 análisis para monitoreo de muerte de las células epidérmicas a lo largo de la evolución de la infección. Se encontró que la muerte celular …

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a las siguientes personas que ayudaron con cría y recogida de datos: Tegtmeier D. C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, Percival S., M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, Harney N. y T. Knavel; y M. Merces ayuda con disecciones. También nos gustaría agradecer a M. McFadden, P. Harlow y Taronga Zoo para aumentar la L. v. alpinay G. Marantelli para levantar los p. corroboree. Agradecemos a F. Pasmans, A. Martel para asesoramiento en ensayos de apoptosis, Constantino C., Kladnik A. y R. Webb ayuda con ensayo TUNEL, y Emeto T. y W. Weßels para ayudan con el protocolo y kit para análisis de caspasas 3/7. Este manuscrito y el protocolo se ha adaptado de Brannelly et al 2017 Peer J22.

Materials

POLARstar Omega BMG Labtech Luminescent plate reader
384 well flat clear bottom plate Corning 3707
384 well low flange white flat bottom plate Corning 3570
Agar Bacteriological (Oxoid) Fisher OXLP0011B
Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin Fisher 6764254
Lactose Broth (Oxoid) Fisher OXCM0137B
Sodium Bicarbonate Fisher BP328-500
Tricane-S (MS-222) Fisher NC0872873
Tryptone Fisher BP1421-500
Bovine Serum Albumin Invitrogen 15561020
Sterile rayon swab Medical Wire & Equipment MW-113
ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit Merck Millipore S7165
Coomassie Bradford reagent Pierce 23200
Caspase Glo  3/7 Promega G8090
HEPES buffer Sigma Aldrich H0887-20ML
Magnesium chloride Sigma Aldrich 1374248-1G
Gelatin hydrolysate Enzymatic Sigma-Aldrich G0262
PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) Thermo/Life 20-012-043
Prepman Thermo/Life 4318930
TaqMan Fast Advanced Master Mix ThermoFisher 4444556
Parafilm Bemis PM996
Clorox bleach Clorox
Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade Fisher BP2818500
ZEISS Axio Scan florescent miscroscope Carl Zeiss Florescent microscope
3.2mm stainless steel beads BioSpec 11079132SS
Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) Taqman Individual design for primers and probe
Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3′) Taqman Individual design for primers and probe
Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) Taqman Individual design for primers and probe
Rotor-Gene qPCR Instruments Qiagen qPCR machine
Microcentrifuge tubes 1.5ml Fisher 02-681-372
Cell culture petri plates Nunc 263991
Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm BioSpec 11079105Z

参考文献

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記事を引用
Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis. J. Vis. Exp. (135), e57345, doi:10.3791/57345 (2018).

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