子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

興味の遺伝子の機能を理解するための古典的な実験パラダイムは、遺伝のモザイクを生成します。遺伝子は細胞の表現型に必要なかどうかを決定するには、最も簡単な方法は有機体 (例えばノックアウト) を通して遺伝子の機能の損失を引き起こしています。ただし、遺伝子が特定の細胞型で特に必要なかどうかを決定、生物全体の遺伝子のノックアウトは有効なアプローチではありません。代わりに、メソッドが必要なしの野生型 (すなわち遺伝的摂動) 組織に囲まれている間特定のセルに遺伝子の機能の損失と、-つまり、モザイク組織を作成します。突然変異体の細胞が突然変異体の表現型を示していますが、周囲の野生型細胞は、細胞自律的方法で遺伝子機能。解析モザイク組織、変異細胞が野生型組織に囲まれているは、遺伝子、特にニューロンとグリア細胞が組織の広大な相互接続ネットワークを形成する脳の細胞の自律的機能の理解に最適です。

モザイク脳組織のいくつかのフォームは、遺伝子の細胞の自律的機能を調べるための強力なモデルを提供しています。神経移植¹、女性 X-リンクされてモザイク^2,3,4に焦点を当てた研究とモザイクに基づいて彼らの結論を描画している内因性の体細胞モザイク^5,6脳組織。Cre lox 組換えシステムを介して遺伝子の条件削除は、トランスジェニック マウス線の偉大な可用性を最大限に活用する方法です。このメソッドは、loxP サイト同じ方向 (“floxed”) の両方の顔が並ぶそれを残して (エクソン) など遺伝子の必要なシーケンスのいずれかの側で 2 つの loxP サイトを紹介しています。Cre リコンビナーゼ loxP サイト⁷間のシーケンスを切り取る。Cre を介する組み換えは、セル (「Cre 記者ライン」) のサブセットに蛍光マーカーと一緒に Cre リコンビナーゼを表現する別のマウス線横断 floxed マウスで実現できます。これは、さまざまな興奮性神経細胞やアストロ サイト⁸などの細胞のサブセットの遺伝子の機能を明らかにする方法で実証されています。Cre 記者行クレエ^T2 (単一ニューロン誘導 Cre を介したノックアウトまたは滑らかでラベル付け) という薬物誘導する Cre を介した結合を許可するを表すことができます⁹。ダブル マーカー (MADM)^10,11モザイク解析と呼ばれる別の戦略、Cre を介した染色体間組換えホモ接合体変異ヘテロ接合体組織と一緒に作成することができます。これらのアプローチのマウスの新しい行は各候補遺伝子またはテストされる細胞のサブタイプのたびに生成される必要があります。イオントフォレシス¹²通したり、ウイルスのベクトル (例えばアデノ随伴ウイルス¹³またはレンチ¹⁴細胞サブタイプに固有を運ぶ Cre リコンビナーゼを後天的導入できる代わりに、発起人)。この戦略は、強いと生後のラベルを作成します。まばらと胎生期大脳皮質ニューロンの開発を対象とするには、理想的な戦略は蛍光マーカーで Cre リコンビナーゼのエレクトロポレーション子宮内です。

体内組織モザイク エレクトロポレーション子宮内で生成する Cre lox 再結合を結合することに加えて、その他公開プロトコルから^{15,16、手順にいくつかの適応を紹介 17,18,19,20,21}。繁殖タイミング妊娠した女性の成功を改善するために情報を提供いたします。我々 はまた、大脳皮質組織の神経細胞の疎と明るいラベリングを導入する我々 の 2 つの戦略を概説: Cre リコンビナーゼの蛍光マーカー²²single コンストラクト コーディングのレベルを滴定する戦略の 1 つです。別の戦略は、心^23,24でこれらのパラメーターを具体的に設計された「超新星」システムを使用することです。さらに、一貫性のあるマイクロインジェクション ピペットと子宮の穿孔手術を簡素化の生産の改善を提供しています。最後に、我々 はさらに汚れるか、または免疫組織化学を樹状突起スパインの樹状突起と軸索のアーバー、分析できる簡易組織の準備で重要な手順を概説します。