DNA che macchia il metodo basato su Formazan precipitazione indotta dall'esposizione alla luce blu
概要
Questo metodo permette la colorazione selettiva e quantificazione del DNA in gel immergendo il gel in un SYBR Green mi / Nitro blu di tetrazolio soluzione e poi esporla alla luce solare o una fonte di luce blu. Questo produce un precipitato visibile e quasi non richiede un equipaggiamento, che lo rende ideale per uso sul campo.
Abstract
Metodi di colorazione del DNA sono molto importanti per la ricerca biomedica. Abbiamo progettato un metodo semplice che permette la visualizzazione di DNA ad occhio nudo dalla formazione di un precipitato colorato. Funziona immergendo l’acrilamide o gel dell’agarosi del DNA in una soluzione di 1 x (equivalente a 2,0 µM) SYBR Green ho (SG ho) e 0,20 mM blu nitro tetrazolium che produce un viola precipitare di formazan quando esposto alla luce solare o in particolare la luce blu. Inoltre, DNA test di recupero sono state effettuate utilizzando un plasmide ampicillina resistente in un gel di agarosio colorati con il nostro metodo. Un maggior numero di colonie è stato ottenuto con il nostro metodo che con tradizionale che macchia usando SG I con illuminazione ultravioletta. Il metodo descritto è veloce, specifici e non tossico per la rilevazione del DNA, permettendo la visualizzazione di biomolecole ad “occhio nudo” senza un transilluminatore ed è poco costoso e adatto per uso sul campo. Per questi motivi, il nostro nuovo DNA che macchia il metodo ha potenziali benefici all’industria e ricerca.
Introduction
Con gli avanzamenti nella biochimica e biologia molecolare, gli studi che coinvolgono il DNA hanno richiesto le tecniche migliori per analizzare il DNA. Il primo metodo per la colorazione del DNA era macchiatura d’argento, che è molto sensibile ma manca selettività e non consente il recupero del campione. In seguito, lo sviluppo di macchiatura del DNA fluorescente permesso la quantificazione selettiva del DNA con la possibilità di recupero del campione. Uno dei primi coloranti fluorescenti utilizzati per la quantificazione del DNA era etidio bromuro1, che è mutageno2. Tuttavia, ora ci sono migliorate le tinture fluorescenti che sono più sicuri e più sensibili, come GelRed e SYBR Green ho (SG ho)3; ma tutti questi coloranti fluorescenti richiedono l’uso di un transilluminatore (UV) ultravioletto o fluorimetro.
Ci sono altre tecniche per visibilmente la colorazione del DNA, come il blu di metilene4 e viola di cristallo5,6,7,8,9, ma tutti questi soffre di ridotta sensibilità e selettività. I sali di tetrazolio sono composti organici suscettibile di riduzione e quando questo accade formano un insolubile e colorata formazan precipitare10,11. Recentemente, alcuni sali di tetrazolio bivalente hanno dimostrati di legarsi al DNA a causa della loro positiva tetrazolium anelli12.
In una recente pubblicazione13, è stata proposta una nuova tecnica visibile di macchia e quantificare il DNA in gel di poliacrilammide, mediante la riduzione di un sale di tetrazolio bivalente chiamato nitro blu di tetrazolio (NBT) e tinture fluorescenti come il bromuro di etidio, GelRed, SYBR Green io e SYBR Gold. Questa reazione ha lavorato in presenza di luce blu o luce del sole e ha permesso il recupero di campione con una migliore qualità rispetto all’uso di SG I con un transilluminatore UV. L’obiettivo di questa carta è di fornire un protocollo dettagliato della tecnica colorazione utilizzando tetrazolium sali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un sensibile e romanzo DNA che macchia il metodo basato su riduzione di NBT e l’uso di SG mi è stato presentato in questo articolo. Il passaggio fondamentale in questo protocollo è il tempo di incubazione del gel in NBT-SG ho soluzione e la concentrazione di NBT. Il tempo di colorazione per i gel dell’agarosi è più per i gel di acrilammide a causa del maggiore spessore del gel dell’agarosi. Questo metodo non funziona bene in presenza di SDS come NBT precipita a contatto con esso. Se il gel ottiene uno sfondo viola, s…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da Fondo Nacional de Desarrollo y Científico Tecnológico (Fondecyt), Cile, progetto 11130263 (in senso orario), progetto CONICYT + NERC + Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (in senso orario) e U-inicia dal de Vicerrectoría Investigación Universidad de Chile (in senso orario).
Grazie a Tatiana Naranjo-Palma per l’aiuto nella fase iniziale di questo progetto, Dr. Jorge Babul e Diego Quiroga-Roger per utile discussione, Robert Lesch per rivedere il manoscritto e la Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas da Universidad de Chile. Grazie anche alla Marcelo Pérez per il video editing e Neil Stevens per la correzione del testo ed Errol Watson per fornire la voce fuori campo.
Materials
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions |
| distilled water | – | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | – | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
参考文献
- LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
- Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
- Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
- Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
- Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
- Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).
- Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
- Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
- Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
- Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
- Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
- Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , (2012).
- Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. . Brock biology of microorganisms. , (2003).
