概要

확산 및 무부하 인간의 섬유 아 세포의 게놈 넓은 사본 감소율을 결정

Published: January 02, 2018
doi:

概要

우리 성적 감소율, 모니터링 및 차동 부패 유전자 식별 생성 확산 및 무부하 기본 인간 피부 섬유 아 세포 프로토콜을 설명 합니다.

Abstract

정지는 임시, 가역 상태 셀 세포 분열을 중지 해야 하지만 증식 하는 능력을 유지. 우리를 포함 한 여러 연구 정지 관련 유전자 발현에 광범위 한 변화 된가 설명 했다. 이러한 변화 중 일부는 수준 또는 확산 관련 된 녹음 방송 요인 E2F MYC 등의 활동에 변화를 통해 발생합니다. 우리 mRNA 감퇴 확산 및 무부하 셀 사이의 유전자 발현에서 변화에도 기여할 수 있다 설명 했다. 이 프로토콜에서 우리 인간의 피부 포 피 섬유 아 세포의 증식 및 무부하 문화를 설정 하기 위한 절차를 설명 합니다. 우리는 다음 악티노마이신 d (ActD) 확산 및 무부하 셀에 새로운 전사를 억제 하는 절차를 설명 합니다. ActD 치료 성적 부패에서 새로운 전사 해리를 간단 하 고 재현성 접근을 나타냅니다. ActD 치료의 단점은 ActD 세포 생존 능력에 영향을 하기 때문에 시간 코스는 짧은 시간 프레임에 제한 되어야 한다입니다. 대 본 수준 사본 감소율을 확인 하려면 시간이 지남에 모니터링 된다. 이 절차는 유전자와 무부하 fibroblasts 대 확산에 차동 부패 하는 isoforms의 식별에 대 한 수 있습니다.

Introduction

성적 증명서의 정상 상태 수준 반영 성적 종합과 성적 부패의 기여. 규제 및 조정된 대 본 부패는 제어 생물 학적 과정1,2,,34중요 한 메커니즘입니다. 예를 들어 성적 감소율 염증 성 cytokine 종양 괴 사 인자5활성화 다음 이벤트의 시간 시리즈에 기여할 표시 되었습니다.

우리는 이전 확산 및 기본 인간 섬유 아 세포에 정지 사이 과도 많은 유전자6의 증명서 수준에 변화와 관련 된 나타났습니다. 이러한 변화 중 일부 녹음 방송 요인의 활동에 이러한 두 상태 사이의 차이 반영합니다.

녹취 록의 부패 속도 변화 또한 두 개의 서로 다른 상태7,8대 본 식 수준에 변화에 기여할 수 있다. 확산 및 정지 사이 과도 여러 microRNAs9의 수준에 변화와 관련 된 우리의 이전 연구 결과 바탕으로, 우리는 또한 변화에 차동 성적 부패에서 기여 여부 요청 무부하 fibroblasts 대 확산에 진 식입니다.

사본을 안정성을 모니터 하기 위해 우리는 성적 무부하 셀 대 확산에 게놈 넓은 감퇴의 속도 결정. 이를 위해, 우리는 새로운 전사의 억제제를 소개 하 고는 개별 성적표 사라진 시간이 지남에 속도 모니터링 하 여 무부하 fibroblasts 대 확산에 감소율 모니터링. 이 방법의 장점은, 단순히 새로운 사본 합성을 억제 함으로써 전체적인 유전자 발현을 모니터링 하는 방법에 비해 우리가 된다는 것에서 그들은 속도는 별도로이 성적에 대 한 부패 속도 확인할 수 복사할 수 있습니다.

새로운 전사를 억제 하 여 사본 감소율을 결정 ActD 치료 여러 이전의 연구에 성공적으로 적용 되었습니다. ActD 프로 염증 성 cytokines5치료에 기인 하는 사본 풍부에서에 RNA 안정성의 중요성을 해 부에 사용 되었습니다. 유사한 접근은 또한 그들은 차별화 된 근육 형10채택 차별화 된 C2C12 셀 대 확산 성적 부패 속도 차이 해 부하 사용 되었습니다. 또 다른 예로, 글로벌 mRNA 반감기 또한 만능에서 발견 된 하 고 차별화 된 마우스 배아 줄기 세포11. 이 예제에서 mRNA 감퇴 사본 풍부 규제에 대 한 및 다른 셀 상태를 셀의 변환에 대 한 중요 한 표시 되었습니다.

아래 설명 된 방법을 적용, 섬유 아 세포 확산 및 무부하 상태12에 비교할 때 약 500 유전자의 사본 감소율에 변화를 발견 우리. 특히, 우리는 예측에 관한 미르 29, downregulated 무부하 셀에는 대상 셀 전환 정지 때 안정화는 발견 했다. 여기 우리 확산 및 무부하 셀에 감소율을 결정 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법론은 급속 하 게 부패 유전자에 대 한 정보는 때 두 비슷한 조건 하지만 뚜렷한 글로벌 mRNA 감퇴 속도 비교 유용 합니다. 그것은 또한 2 차원 3 차원 문화 대에서 성적 부패, 예를 들어, 셀 문화 조건의 효과 등 다른 질문을 해결 하기 위해 사용 될 수 있습니다. 감소율 등 microarrays RNA 시퀀스 또는 실시간 정량 Pcr 방법 결정된 게놈 넓은 수 또는 북부 blotting 유전자, 유전자 또는 isoform에 의해 isoform 기준 감소율을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 요금은 각 모니터링된 유전자의 반감기를 계산 하 고 부패 속도 두 가지 조건에 다른 유전자를 식별 하 사용할 수 있습니다.

Protocol

설명 하는 모든 실험은 프린스턴 대학, 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스에서 제도적 검토 보드에 의해 승인 되었다. 1. ActD 시간 코스에 대 한 확산 및 접촉 저해 Fibroblasts 준비 참고:이 프로토콜 사용 하는 timecourse 4 timepoints입니다. 3 생물학으로 독립적인 샘플 timepoint 당 1 개의 실험에서 다른 조직 문화 접시를 수집 하 여 수집 될 수 있습니다 또는 실험 세포?…

Representative Results

우리 이전 8 시간 코스12통해 확산 및 접촉 저해 기본 인간 섬유 아 세포에서 사본 감소율의 microarray 분석의 결과 보고 있다. 확산 및 접촉 저해 fibroblasts 비교 성적 안정성에 중요 한 변화는 유전자 목록이 보충 표 1에 제공 됩니다. 형광 강도 ActD 치료 후 시간 코스 이상과 시간 0에 제공 됩니다. 유전자는 ANOVA F-검정을 사용 하 여 확산 하 고 접?…

Discussion

정지는 mitogens 또는 혈 청의 철수, 세포 접착 및 접촉 금지의 부족을 포함 하는 외부 신호에 의해 유도 될 수 있다. 접촉 금지, 정지, 유도 대 한 여러 가지 방법 중 하나는 세포 증식 세포 주기 세포 세포 접촉에 대 한 응답에서 종료 매우 진화론 보존된 과정 이다. 우리는 정지를 유도 하는 방법의 예를 들어 접촉 저해에 여기 초점. 이전 연구 보고가 셀 셀 문의 예측에 관한 속25에 ?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

HAC 리 타 알 렌 재단 (http://www.ritaallenfoundation.org)의 밀 튼 중 카셀 학자 이었다. 이 작품 HAC 우수성 그랜트 P50 GM071508의 국립 연구소의 종합 의료 과학 센터에서 (탐정 데이비드 Botstein), PhRMA 재단 그랜트 2007RSGl9572, 국립 과학 재단 부여 OCI-1047879 데이비드 8 월에 교부 금에 의해 투자 되었다 일반 의료 과학 R01 GM081686, 국립 연구소의 종합 의료 과학 R01 GM0866465, Eli의 국립 연구소 & 재생 의학의 Edythe 넓은 센터 & 줄기 세포 연구, 아이리스 칸토어 여자 건강 센터/UCLA CTSI NIH 그랜트 UL1TR000124, 그리고 백혈병 림프 종 사회입니다. 이 간행물에 보고 된 연구 보너스 번호 P50CA092131에서 국립 보건원의 국립 암 연구소에 의해 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. HAC는 Eli의 멤버인 & Edythe 넓은 재생 의학 센터 & 줄기 세포 연구, UCLA 분자 생물학 연구소와 UCLA 생물 정보학 각 부처간 프로그램.

Materials

Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C
Equipment for running agarose gels
Sterile tissue culture plates and conical tubes
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-118
Fetal bovine serum VWR 35-010-CV
Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture
Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis
Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples
RNaseZap Invitrogen AM9780 For decontaminating work surfaces from RNase
2.0 ml eppendorf tubes
Trypsin-EDTA  Solution 10X Millipore Sigma 9002-07-07
Sterile PBS Life Technologies 14190-250
Trizol Thermo Fisher Scientific 15596018
Actinomycin D Millipore Sigma A1410-2 mg inhibits transcription
Sterile DMSO Fisher Scientific 31-761-00ML solvent for actinomycin D
Chloroform Thermo Fisher Scientific ICN19400225 MP Biomedicals, Inc product
Isopropanol Fisher Scientific BP2618500 molecular biology grade
Ethanol Fisher Scientific BP28184 molecular biology grade
RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) Thermo Fisher Scientific R0551 carrier for RNA precipitation
TURBO DNA-free Kit Thermo Fisher Scientific AM1907 removes DNA with DNase, then, in a subsequent step,  inactivates DNA and removes divalent cations
Agarose Thermo Fisher Scientific ICN820721 MP Biomedicals, Inc product
Loading dye for RNA gel Thermo Fisher Scientific R0641 suitable even for denaturing electrophoresis
Millenium RNA markers Thermo Fisher Scientific AM7150 RNA ladder
One-color RNA Spike-in Kit Agilent Technology 5188-5282 Example spike-in control for Agient microarray analysis
Tris base Fisher Scientific BP152-1 molecular biology grade, for TAE buffer
Glacial acetic acid Fisher Scientific A38-500 for TAE buffer
EDTA Fisher Scientific BP120-500 electrophoresis grade, for gels
Ethidium bromide Millipore Sigma E7637 for molecular biology
External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix Thermo Fisher Scientific 4456740 Spike-in control for RNA Seq
TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) Illumina RS-122-2101 for RNA Seq
96-well 0.3 ml PCR plate Thermo Fisher Scientific AB-0600 for real-time qPCR
Microseal B adhesive seals Bio-Rad MSB1001 for real-time qPCR
Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs VWR 89094-662 for real-time qPCR
Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps Thermo Fisher Scientific AM12230 for real-time qPCR
SuperScript Reverse Transcriptase Invitrogen 18090010 for real-time qPCR
AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 for real-time qPCR

参考文献

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記事を引用
Mitra, M., Lee, H. N., Coller, H. A. Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts. J. Vis. Exp. (131), e56423, doi:10.3791/56423 (2018).

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