概要

Estudos do Vírus Influenza A em um Modelo de Infecção de Camundongos

Published: September 07, 2017
doi:

概要

Vírus da influenza A (IAVs) são importantes patógenos respiratórios humanos. Para entender a patogenicidade de IAVs e realizar testes pré-clínicos de vacina romance abordagens, modelos animais, imitando a fisiologia humana são necessários. Aqui, descrevemos técnicas para avaliar a patogênese do IAV, respostas humorais e eficácia de vacina usando um modelo do rato da infecção.

Abstract

Vírus da gripe causam mais de 500.000 mortes em todo o mundo1 e estão associados a um custo anual de US $ 12 bilhões nos Estados Unidos sozinho, considerando médica direta e as despesas de hospitalização e de absentismo de trabalho2. Modelos animais são cruciais em estudos de Influenza A virus (IAV) para avaliar a patogênese viral, as interações patógeno-hospedeiro, respostas imunes, e a eficácia da vacina atual e/ou nova abordagens bem como antivirais. Ratos são um modelo animal pequeno vantajoso porque seu sistema imunológico é evolutivamente semelhante ao encontrado em seres humanos, eles estão disponíveis de fornecedores comerciais como indivíduos geneticamente idênticos, há múltiplas variedades que podem ser exploradas para avaliar a base genética das infecções, e são relativamente baratos e fáceis de manipular. Para recapitular infecção IAV nos seres humanos através das vias aéreas, os ratos são primeiro anestesiados antes da inoculação intranasal com infecciosas IAVs sob contenção adequada de biossegurança. Após a infecção, a patogênese da IAVs é determinada pelo monitoramento diário da morbidade (perda de peso de corpo) e a taxa de mortalidade (sobrevivência). Além disso, a patogênese viral também pode ser avaliada por avaliar a replicação do vírus no superior (mucosa nasal) ou inferior (pulmões) do trato respiratório de ratos infectados. Respostas humorais após infecção IAV podem ser rapidamente avaliadas por sangramento não-invasiva e detecção do anticorpo secundário ensaios destinados a detectar a presença de total ou anticorpos neutralizantes. Aqui, descrevemos os métodos comuns usados para infectar camundongos practicar (i.n) com IAV e avaliar a eficácia de proteção, humorais respostas imunes e patogênese.

Introduction

IAVs são vírus envelopadas classificados na família Orthomyxoviridae 3. Eles contêm oito moléculas de RNA único-encalhado com polaridade negativa3. Em humanos, IAVs causam epidemias sazonais e ocasionais pandemias de consequência importante quando novos vírus são introduzidas na população humana4. Além disso, IAVs sazonais são altamente e rapidamente transmitidos entre os seres humanos, produzindo uma elevada perda econômica em todo o mundo a cada ano2,5. IAV os sintomas incluem tosse, congestão nasal, febre, mal-estar, dor de cabeça, anorexia e mialgia, mas o vírus também pode produzir uma doença mais grave em pacientes imunocomprometidos6. Na verdade, a Organização Mundial de saúde (OMS) calcula que os vírus da gripe sazonal com 300.000-500.000 mortes em todo o mundo que cada ano1. Existem apenas duas classes de drogas atualmente aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA) para a profilaxia de gripe e tratamento em seres humanos: inibidores de neuraminidase (NA) (por exemplo, oseltamivir) e bloqueadores do canal de íon M2 (por exemplo, Amantadina); no entanto, o surgimento de variantes do vírus resistentes aos medicamentos é uma preocupação crescente. Vacinação, portanto, continua a ser a melhor opção de médica para proteger os humanos contra infecções IAVs. Até à data, três tipos de gripe, as vacinas licenciadas pelo FDA para uso humano estão disponíveis: vacinas de proteína hemaglutinina viral recombinante (HA), inactivadas (IIV) vacinas contra a gripe e viver-atenuado gripe vacinas (LAIV)5, 7. as três vacinas são projetadas para induzir resposta imune adaptativa contra a proteína viral HA, o alvo principal dos anticorpos contra IAVs neutralizantes.

Um modelo de mouse validado para estudar IAV infecção na vivo

Modelos animais têm sido usados para estudar, entre outros, IAV patogênese8,9,10,11, virais fatores que contribuem para doença12 e/ou transmissão viral13 ,14, e testar a eficácia de novas vacinas ou antiviral drogas9,10,15. Camundongos (Mus musculus) são o modelo animal mais extensivamente usado para pesquisa IAV por vários motivos: 1) o sistema imunológico é evolutivamente semelhante ao que se apresentam nos seres humanos; 2) compra animal de baixo custo, incluindo, moradia e reprodução; 3) pequeno tamanho facilmente manipular e armazenar; 4) variabilidade do anfitrião mínima para obter respostas homogêneas e resultados; 5) amplo conhecimento da biologia de ratos, incluindo a sequência do genoma; 6) muitos disponíveis de biologia molecular e/ou reagentes Imunologia; 7) disponível nocaute (KO) ratos para estudar a contribuição de uma proteína do hospedeiro na infecção viral; e, 8) múltiplas variedades do mouse que podem ser exploradas para avaliar as bases genéticas de infecções.

Existem várias cepas de rato atualmente disponíveis para estudar IAV na vivo. Idade, estado imune, sexo, estirpe genética de fundo e mouse, bem como rotas de infecção, dose e estirpes virais influenciam o resultado da infecção do IAV em camundongos. As cepas de rato mais comuns utilizadas na investigação IAV são C57BL/6, BALB/C e, mais recentemente, DBA.2 ratos, desde que eles são mais suscetíveis à doença do IAV que as duas linhagens ex16,17,18, 19 , 20. importante, a resposta imune também pode ser diferente dependendo o rato estirpe18,19,20. Assim, é muito importante recuperar todas as informações disponíveis sobre o mouse e a estirpe do IAV para escolher a melhor opção para o experimento a ser realizado.

Embora o rato é um bom modelo animal de infecção para estudos em vivo com IAV, eles têm várias limitações, que precisam ser considerados no projeto experimental. Por exemplo, uma grande limitação do uso de ratos para estudos em vivo é que IAVs não transmitem entre ratos. Assim, para a transmissão de estudos, mais aceitos modelos animais (por exemplo, furões ou cobaias) são usados16,17,21. Além disso, existem várias diferenças entre as manifestações da IAV em camundongos e humanos. Ao contrário dos humanos, os ratos não desenvolvem febre após infecção IAV; por outro lado, eles apresentam com hipotermia16,17. Em camundongos, replicação IAV está concentrada no trato respiratório inferior (pulmões) em vez de vias aéreas superiores. Assim, virulência do IAV em ratos não é sempre correlacionada ao observado em seres humanos. No total, porque as vantagens superam as desvantagens limitadas, rato representa o primeiro modelo animal usado para avaliar a patogênese viral da gripe, imunogenicidade e eficácia protetora em estudos de vacina e antiviral. Além disso, não seria eticamente aceitável para realizar estudos com IAV usando modelos animais grandes sem provas anteriores em um modelo animal pequeno de infecção IAV. Neste manuscrito, descrevemos como infectar camundongos practicar (óssea) com IAV, como monitorar a gravidade e o progresso da infecção viral e como realizar as experiências necessárias para avaliar humorais respostas imunes e eficácia de proteção.

Protocol

todos os protocolos animais descritos aqui foram aprovados pelo cuidado Animal institucional e Comissão de utilização (IACUC) e a Comissão de biossegurança institucional (IBC) na Universidade de Rochester faculdade de medicina e odontologia e cumprir com as recomendações do guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório do nacional pesquisa Conselho 22. As instalações e programas do viveiro e divisão de laboratório de medicina Animal da faculdade de medicina e odontologia são acreditados pela AAALAC …

Representative Results

Caracterização de patogênese viral em camundongos A patogênese da IAV está relacionada a morbidade e a mortalidade causada por sua infecção. Esses dois parâmetros podem ser avaliados em camundongos facilmente: morbidade IAV está associada a perda de peso corporal em camundongos infectados e a porcentagem de sobrevivência irá indicar a taxa de mortalidade (Figura 1). O peso corporal e sobrevi…

Discussion

O modelo do rato do IAV é amplamente utilizado na vivo estudos de eficácia de proteção, a imunogenicidade e a patogênese do IAV. O pequeno tamanho dos ratos torna fácil de manipular e armazenar em comparação com outros modelos animais, como furões ou cobaias. Além disso, a facilidade em termos de custo de animal, habitação e reprodução permitem sua utilização em testes pré-clínicos vacinação em que um grande número de animais é necessários. Notavelmente, desde que os ratos têm sido usados…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Pesquisa sobre o vírus da gripe em laboratório LM-S é parcialmente financiada pelo The New York gripe centro de excelência (NYICE), um membro dos NIAID centros de excelência para a investigação de Influenza e vigilância (CEIRS). Agradecemos seu apoio nas correções do manuscrito Wendy Bates.

Materials

Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells ATCC CCL-34
Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice National Cancer Institute (NCI) 01XBE
Turckey red blod cells Biolink Inc Store at 4°C
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4°C
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20°C
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100X Corning 30-009-CI Store at -20°C
Penicillin/Streptomycin (PS) 100X Corning 30-00-CI Store at -20°C
Bovin Albumin solution (BA) Sigma-Aldrich A7409 Store at 4°C
Bovin Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9647 Store at 4°C
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin Sigma-Aldrich T8802 Store at -20°C
Neutral Buffered Formalin 10% EMD 65346-85 Store at RT
Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at RT
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 ATTC H16-L10-4R5 Store at -20°C
Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC Dako F0261 Store at 4°C
ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody GE Healthcare LNA931V/AG Store at 4°C
TMB substrate set BioLegend 421101 Store at 4°C
Vmax Kinetic plate reader Molecular Devices
Dounce Tissue Grinders Thomas Scientific 7722-7
Receptor destroying enzyme, RDE (II) Denka Seiken Co. 370013 Store at -20°C
Crystal Violet Fisher Scienctific C581-100 Store at RT
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
Cell Culture dishes 100mm Greiner Bio-one 664-160
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Fisher Scienctific 269620
Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates Thermo Fisher Scienctific 249570
Puralub Vet Ointment Dechra 9N-76855
Fluorescent microscope Olympus Olympus IX81

参考文献

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記事を引用
Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (127), e55898, doi:10.3791/55898 (2017).

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