ODELAY: une méthode à grande échelle pour la quantification multiparamétrique de la croissance de la levure

1. Préparation du stock de gel d'agarose Pesez 2 g d'agarose de haute pureté. Ajouter l'agarose dans une bouteille de 500 mL et enregistrer leur masse combinée. Calculez la masse cible de la bouteille plus 2 g d'agarose avec 150 g d'eau ultra-pure, puis ajoutez 150 g d'eau ultrapinte à 0,1 g de cette masse cible. Notez la masse de la bouteille plus l'agarose et l'eau. Placez la bouteille dans un micro-ondes et assurez-vous d'ajuster la bouteille avec un capuchon desserré sur le dessus pour minimiser l'évaporation de l'eau tout en chauffant l'agarose. Faire cuire la bouteille dans des rafales de 15 à 20 s, puis faire tourner brièvement la bouteille pour mélanger l'agarose et l'eau. Répétez cette procédure jusqu'à ce que la solution ébullisse et que le mélange soit homogène. ATTENTION: Veillez à éviter les écailles de peau avec de la vapeur s'échappant de la bouteille. En outre, la bouteille devient chaude au toucher et une protection appropriée, comme un gant autoclave, est nécessaire pour éviter les blessures. Après que l'agarose fondu est homogène, pesez de nouveau la bouteille et ajoutez de l'eau ultrapure à 0,1 g de la masse d'origine. Cela remplacera toute perte d'eau due à l'évaporation. Avant que l'agarose fondu se solidifie, tourbillonner pour mélanger dans l'eau ajoutée pour assurer l'homogénéité. Aliquotez 15,2 g d'agarose dans des tubes en plastique de 9 à 50 ml. Réfrigérer les tubes jusqu'à ce qu'il soit nécessaire. 2. Préparation de l'ODELAY Agarose Media Faire chauffer 400 ml d'eau désionisée pour faire bouillir dans un bécher couvert, sur une plaque chauffante sous agitation douce avec une barre d'agitation magnétique. Ajouter 2 mL de milieux 10X ( p . Ex ., Peptone d'extrait de levure (YEP) ou Mélèt complément complémentaire (CSM)) dans une portion aliquote d'agarose de 15,2 g dans un tube conique de 50 ml de l'étape 1.10. REMARQUE: Le support CSM tend à coller aux diapositives en verre. Si vous utilisez des formulations de média CSM, ajouter 5 μL de polyéthylèneglycol (PEG) à 50% en poids dans de l'eau stérile à la formulation moyenne. Le PEG empêche l'aGar de collage aux diapositives en verre pendant la libération du moule et n'inhibe pas la croissance de la levure. Ajouter des suppléments nutritifs supplémentaires de 100X, si nécessaire, et utiliser de l'eau pour ramener le volume total ajouté de cette étape à 1 ml. Peser l'alipoté d'agarose avec des milieux ajoutés et des suppléments avant de placer le tube conique de 50 ml dans l'eau bouillante de l'étape 2.1. Après 16 min, extraire le tube de 50 ml et homogénéiser le mélange en utilisant un vortex. Gardez le capuchon serré sur le tube conique de 50 ml. REMARQUE: Un couvercle sur le bécher aide à chauffer le tube entier de façon égale, sinon un film d'agarose solide se forme et peut-être ne pas fondre. Aussi pendant ce temps, il est commode d'assembler le moule d'agarose ( Figure 1 ). Homogénéiser le mélange à l'aide d'un vortex. Faire bouillir pendant 2 minutes supplémentaires pour s'assurer que toutes les agar sont mélangées et fondues. Peser le tube et remplacer toute perte de masse avec de l'eau stérile ultra-pure. Ajouter 2 mL de 10X carbon-azur(Par exemple , 20% p / v de glucose) et le vortex pour obtenir une solution de milieu d'agarose. REMARQUE: Séparation des diapositives en verre: Lors de l'assemblage du moule, il faut veiller à ce que les entretoises longues soient placées dans le moule avec l'orientation correcte. C'est parce que comme le laser coupe l'acrylique, il a tendance à se couper en tant que cône en laissant la partie avec des côtés légèrement inclinés au lieu de précisément des côtés de 90 °. Ensuite, lorsque le moule est placé sur le dessus de la table pour libérer le verre de la gélose, le bord de l'entretoise doit être à un angle aigu avec la gélose. L'angle aigu aide à comprimer le bord de la gélose loin du morceau supérieur de verre lorsque le bord extérieur de l'entretoise de moule pivote autour du bord inférieur (voir la figure 1 ). Le résultat est une séparation plus constante de la gélose de la partie supérieure du verre. REMARQUE: Les agents de démoulage appliqués sur les huiles de verre, les pulvérisateurs de silicium ou même les vitrines commerciales ne doivent pas être utilisés car ils contamineront les s. Urface de la gélose et éventuellement inhiber la croissance. Ces méthodes prennent une certaine mesure pour être cohérentes. Nettoyez quatre diapositives en verre de 2 en x 3 dans x 1 mm d'épaisseur avec 70% d'éthanol et séchez en utilisant de l'air forcé. Nettoyez les moules acryliques à 70% d'éthanol, séchez-les et assemblez-les comme le montre la figure 1 . Prenez les trois morceaux inférieurs, comme indiqué, et assemblez-les pour que les deux pièces identiques sèchent la troisième pièce ( figure 1B ). Fixez les pièces de base de chaque côté à l'aide de deux petits agrafes ( Figure 1C ). Placez les montants dans le moule en vous assurant que le laser kerf est correctement positionné ( Figure 1E ). Placez la glissière de verre nettoyée et séchée sur le moule et maintenez-la en place en plaçant une deuxième glissière en verre de l'autre côté. Serrer l'ensemble avec un agrafeur plus grand ( Figure 1D ). Fixez les deux glissières avec des clips de liant plus gros (Lass = "xfig"> Figure 1D). Assurez-vous que le clip du classeur supérieur est en contact avec le glissement de verre se chevauchant avec l'acrylique. Ajouter les autres agrafes de classeurs. Encore une fois, assurez-vous que les pinces entrent en contact avec la glissière où elles chevauchent l'acrylique ( Figure 1D ). REMARQUE: Avant de remplir le moule assemblé avec de l'agar en fusion, assurez-vous que les bords sont scellés en pipetant environ 70 μL de milieu de gélose fondu le long du côté intérieur du moule. Cette gélose se solidifie rapidement et empêche toute fuite. Remplissez le moule avec de l'agar en fusion, en vous assurant d'éviter de piéger les bulles d'air dans le moule. REMARQUE: ceci peut être réalisé en pipetant lentement l'agar fondu le long du bord du moule. Une fois rempli, laisser refroidir le moule pendant 40 min à 1 h à une température ambiante d'environ 23 ° C. Si on laisse refroidir trop longtemps, l'agar peut se fracture dans le moule. REMARQUE: Séparation du moule: l'élimination appropriée du moule de l'agar moulé est essentielle pour assurer un solide uniformeAgar-pad pour la croissance de la levure. Le fait de ne pas assurer une séparation efficace du moule à cette étape entraînera des différences de croissance qui sont attribuables aux imperfections dans l'agar-agar solide. Pratiquer cette étape à plusieurs reprises est recommandé. Commencez par enlever le clip de classeur inférieur. Retirez la partie inférieure du moule qui se compose des trois pièces en sandwich. Tenez les diapositives en les comprimant, puis retirez les clips. Assurez-vous de ne pas heurter les côtés du moule lorsque vous retirez les attaches. Cela déforme les médias. Placez le moule sur le bord du dessus du banc afin que le côté du moule avec le point bleu soit vers le haut et dans le coin inférieur gauche ( Figure 1E ). Placez les pouces sous l'acrylique et le premier doigt sur le dessus vers le bord intérieur du moule. Poussez doucement et avec précaution avec le pouce contre le moule, comme si le pivotement de l'entretoise de moule à son bord inférieur ( Figure 1F ). Appliquer constanteMais en augmentant lentement la pression. Les utilisateurs verront une rupture et une bulle d'air apparaîtra le long de la ligne où le verre supérieur couvre l'espaceur de moule. Après avoir vu la ligne de coupure initiale, continuer à pousser avec des pouces et appliquer une pression constante. L'agar devrait commencer à se détacher du verre à ce point ( Figure 1F ). Continuez à pivoter le moule vers le haut. Cela va soulever le verre sans le glisser. Une ligne où l'agar se détache du verre devrait continuer à s'éloigner de la ligne de rupture initiale. REMARQUE: à ce stade, la gélose colle au fond et au dessus du verre. Cela se produira parfois avec la plus grande partie de la gauche. Tant que la zone déformée n'est pas dans la zone où la levure est repérée, cela devrait être bien. Comme le verre est complètement libre, saisissez-le et retirez-le complètement du moule. Ensuite, retirez l'autre pièce de moule en utilisant un mouvement similaire pour soulever la pièce sans déplacer l'agar. Placez les diapositives dans unBoîte à pointe stérile avec une eau stérile de haute pureté dans le fond. Fermez la boîte et conservez à 4 ° CO / N pour l'utilisation le lendemain. Si elles sont stockées plus longtemps, les taux de croissance deviendront incohérents. 3. Préparation de la culture ODELAY Disposer des souches dans une plaque de 96 puits pour la croissance O / N. Le lendemain, diluer 20 μL de culture de nuit dans 200 μL de média pour 220 μL de volume total dans une nouvelle assiette. Mesurer la densité optique à 600 nm (OD600) de chaque culture dans un lecteur de plaques. En utilisant un lecteur de plaques et un robot de manipulation de liquide, suivez le protocole de dilution automatique des étapes 3.3.1 – 3.3.6. Diminuer manuellement les cultures dans la plaque à environ 0,1 OD600 (facultatif). Sur le lecteur de plat, appuyez sur "Expérience" sous "Créer nouveau". Choisissez ODELAYDilution.exp et exécutez l'expérience. Entrez le nom de l'expérience comme ODELAY "Date" "Heure" "Itinéraire de l'expérience" itération. Cliquez sur le sOnglet tatistics, puis cliquez sur l'icône Excel. Enregistrez les données dans une clé USB et transférez-la à un ordinateur robot de traitement des liquides. Ouvrez la mise en page et l'éditeur de méthodes du robot. Ouvrez le fichier Méthode "ODELAYDilution_v1.med". Exécutez l'exécutable "Convert_SynergyFiles.exe". Entrez 0,09 pour la cible OD600. Cliquez sur "Glu Correction" et "Gal Correction" à 0.05. Mesurez les supports vierges dans une plaque identique. Cliquez sur "Générer un fichier". Sélectionnez le fichier dans l'éditeur de méthode. Cliquez sur l'icône du feu stop pour démarrer la méthode pour ouvrir le programme de dilution d'exécution. Assurez-vous que les tubes ne sont pas pliés et que les plaques ont des bouchons et que les revêtements anti-poussière sont retirés des embouts. Chargez les plaques, les tubes et les pointes sur le pont du robot de traitement des liquides, comme indiqué par la disposition du pont. Cliquez sur le bouton "Jouer" pour exécuter le programme de dilution. Sélectionnez le bon nombre de conseils de 50 μL. Sélectionnez le bon nombre de pointes de 300 μL. Attendez à propos de12 min pour le processus à exécuter. Prenez la plaque de dilution du robot, recouvrez les pointes et récapitulez les tubes de 15 mL. Cultiver la plaque pendant 5 à 6 heures à 30 ° C. Environ 1 à 2 h avant de commencer la deuxième dilution, assurez-vous d'allumer les chambres d'incubation pour le microscope. Laissez-les s'équilibrer à ° C ou à la température requise pour l'expérience. Répéter les étapes de dilution 3.3 – 3.4, mais diluer les cultures à une OD600 de 0,01 à 0,02 pour repérer les cultures sur des lames d'agarose. Couvrir la plaque de dilution avec un joint de congélation en métal. Sonicate la plaque de dilution dans un bain de glace pendant 30 s avec la plaque flottant dans de l'eau glacée à l'aide d'un godet centrifuge pour tenir la plaque ( figure 2A ). Transférer les cultures sonicées de la plaque de dilution à une plaque de fond plat. Étiquetez les plaques à fond plat de 4 x 96 puits 1, 2, 3 et 4 ( figure 2B ). Transfert 150 &# 181; L de la plaque de dilution des puits A01 – D06 dans les puits C04 – F09 de la plaque étiquetée 1. Transférer ensuite 150 μL de la plaque de dilution des puits A07 – D12 dans les puits C04 – F09 de la plaque étiquetée 2. Transférer ensuite 150 μL De la plaque de dilution des puits E01 – H06 dans les puits C04 – F09 de la plaque étiquetée 3. Enfin, transférez 150 μL de la plaque de dilution des puits E07 – H12 dans les puits C04 – F09 de la plaque marquée 4. Passez à l'étape 4, Spotting on Agar. 4. Spotting on Agar à l'aide d'un robot automatisé de détection de liquide Retirez les diapositives d'agarose stockées à 4 ° CO / N (à partir de l'étape 2.19) à partir de leurs boîtes de pipettes stériles humidifiées. Si nécessaire, découpez les coins du milieu d'agarose avec une lame de rasoir propre pour s'assurer qu'ils s'adapteront à la chambre à coulisse. Retirez la pince de glissement de la monture. Placez soigneusement la plaque de gélose dans la zone en retrait du support de la chambre de scène. REMARQUE: assurez-vous que le ouL'orientation de la diapositive est cohérente de l'expérience à l'expérience. Assurez-vous que la pince est alignée avec le fond de la chambre. S'il est tortueux, la glissière peut ne pas être complètement assise dans la zone en retrait. Placez l'entretoise de nivellement dans la position de plaque centrale du robot spotting. Cette entretoise fournit un contact pour les vis de nivellement afin que la chambre à glissière puisse être nivelée avec les pointes. Placez les assiettes sur la table dans l'ordre de leur quadrant. Les plaques 1, 2, 3 et 4 commandées de gauche à droite ( figure 2B ). Déposez les conseils pour que les 24 puits intérieurs C04 – F09 soient occupés avec des pointes dans 4 boîtes à pointe vide. Une cinquième boîte devra avoir une pointe dans la position C10, ainsi que 4 pointes avec leurs extrémités coupées dans les positions A01, A12, H01 et H12. Ces 4 boutons coupés fournissent une stabilité pour la pince de la plaque de pointe ( Figure 2C et 2D ). Retirez le capot supérieur du slMonture de chambre ide. Placez le premier poinçon sur le site de départ du programme de repérage du contrôle du robot. Cela devrait perforer un trou dans l'agarose qui sera ensuite utilisé pour aligner la coordonnée d'origine. Placer la plaque 1 sur le robot de traitement des liquides pour repérer le premier quadrant. Assurez-vous que le couvercle est retiré et continuez le programme de repérage. Assurez-vous que tous les points sont présents. Aussi, attendez ~ 30 s pour qu'ils sèchent. Lorsque les taches ont environ 1 mm de diamètre, le programme peut continuer. Videz les conseils utilisés dans le récipient à risque biologique et placez des pointes fraîches sur le robot. Échangez la plaque 1 pour la 2ème plaque quadrante. Répétez pour le troisième quadrant. Et répétez-vous pour le 4ème quadrant. Lorsque les taches sont sèches, remplacez le couvercle de la chambre à coulisse et retournez l'appareil. Installez les connexions du tube avec un filtre à air. Placez une glissière en verre sur le côté supérieur de la chambre. REMARQUE: cette diapositive est cruciale pour réduireLe flux de chaleur à la gélose et minimise la formation de condensation sur le côté de recouvrement de l'objectif de la chambre. N'oubliez pas cette couverture. En fonction de la configuration du microscope, ce couvercle empêche le chauffage du côté de l'éclairage de provoquer une condensation du côté de l'objectif. Placez un ventilateur pour souffler de l'air chaud sur le côté objectif de la chambre. Ce ventilateur empêche la formation de condensation sur le cache. Réglez le débit d'air dans le barboteur à 10 ml / min. 5. Exécuter ODELAY sur le microscope Exécutez le script "ODELAY_Microscope_Control.m". Cliquez sur le "Obturateur" pour ouvrir l'obturateur lumineux transmis, puis le bouton "Mise au point" pour lancer le taux de caméra élevé ( Figure 3A , Flèches rouges). Cliquez sur "Go Origin" et déplacez la scène pour trouver la marque d'origine perforée dans la gélose. Puis déplace légèrement vers la droite pourMettez l'accent sur les cellules de levure repérées dans la zone E07. Revenez au poinçon d'origine et centrez-le dans le champ de vision. Réglez l'origine de cette valeur en appuyant sur le bouton "set" ( Figure 3A , Blue Arrows). Maintenant, passez à la position H18 et concentrez-vous à l'aide de la vis hexagonale la plus proche de cet endroit. Ensuite, passez à la position L07 et concentrez-vous à l'aide de la vis hexagonale la plus proche de cet endroit. Ensuite, passez à la position E07 et concentrez-vous à l'aide de la vis hexagonale la plus proche de cet endroit. Répétez les étapes 5.5 – 5.7 si nécessaire jusqu'à ce que ces positions restent en foyer. Vérifiez la mise au point au centre et aux bords des points E12, H12, L12. Réglez la plage de mise au point automatique si les valeurs Z de mise au point, telles que indiquées par la valeur Z, sont supérieures à ± la plage de mise au point automatique ( p . Ex ., Réglez la plage de mise au point automatique à 60 μm de la valeur Z pour un point central supérieur à ± 40 μm). Appuyez sur le bouton de réinitialisation, car cela activera les propriétés du bouton, puis appuyez surODELAY ( Figure 3A , flèches vertes). Choisissez le répertoire pour enregistrer les données. Assurez-vous que suffisamment d'espace disque disponible. REMARQUE: Le microscope collecte les données pendant 48 h, ou jusqu'à ce que le programme soit fermé. 6. Traitement des données ODELAY Ouvrez ODELAY_IPT.exe ou utilisez le script ODELAY_Image_Processing_Tool_v7.m script ( Figure 3C ). Préparez une feuille de calcul * ODELAYExpDisc.xlsx excel. Nommez l'expérience dans la cellule B1. Sélectionnez le répertoire d'images où les fichiers d'image E07-H18 sont stockés. Sélectionnez le répertoire de données où les données seront écrites. Écrivez la date à laquelle l'expérience a débuté dans la cellule B04. Utilisez le format MM / DD / AAAA. Ecrivez le temps de dilution dans la cellule C04. Cette fois est environ cinq minutes avant que la première image ne soit collectée. Utilisez le format HH: MMpm où HH est pour h et MM pour min. Ajouter les noms de contraintes en fonction de tO la plaque source (étape 3.1). En raison de la façon dont les souches sont repérées, elles sont réarrangées sur la lame d'agarose ODELAY. Les cellules de la feuille de calcul B31-B126 sont la plaque source, tandis que les cellules C31-C126 sont les emplacements dans la plaque d'agar ODELAY. Ensuite, appuyez sur le bouton "Process Data" et sélectionnez * ODELAYExpDisc.xlsx qui a été préparé. Attendre 16-24 h selon le système informatique utilisé pour traiter les données. Lorsque les images sont traitées, un répertoire nommé "ODELAY Well Data" et un fichier "* _Index_ODELAYData.mat" apparaîtront. Appuyez sur le bouton "Charger données" et sélectionnez le fichier "* _Index_ODELAYData.mat" qui vient d'être généré. Cela va charger l'ensemble de données qui vient d'être traité. Le "*" dans le nom du fichier sera répertorié selon le nom de l'expérience saisi dans la feuille de calcul Excel. Après avoir chargé les données, inspectez-la à l'aide de la barre de temps trouvée en bas, cliquez sur un carré d'image pour voir les courbes de croissance fOu cet endroit, ou trouver un intérêt pour la liste sur la gauche, puis charger les images pour cette liste. Générer des histogrammes de paramètres de croissance de la population en appuyant sur le bouton "Violon Plot". Cela générera un graphique illustré à la figure 4 ou à la figure 6 .