Analisi istologiche di lesioni al fegato acuto alcolico in Zebrafish

La malattia alcolica del fegato (ALD), causata dal consumo di alcol, è una delle principali cause della morbilità e della mortalità correlate all'alcol. Negli Stati Uniti, quasi la metà delle morti per malattie epatiche coinvolge l'alcool ¹ e l'ALD è responsabile di quasi 1 su 3 trapianti di fegato ² . ALD ha un ampio spettro. La steatoside, caratterizzata da un eccesso di accumulo lipidico negli epatociti, si verifica nella fase iniziale del consumo pesante ed è reversibile alla cessazione dell'uso dell'alcol. Sotto l'influenza dei fattori genetici e ambientali e dell'assunzione continua dell'alcol, la steatosi epatica può progredire all'epatite alcolica e, alla fine, alla cirrosi ³ . Gli studi che utilizzano i modelli di roditore ALD hanno fornito conoscenze approfondite sulla malattia, ma hanno limitazioni (esaminate nel riferimento ³ ). L'alimentazione orale di una dieta dell'alcool provoca solo steatosi nei roditori ^{4 , <}/ Sup> ⁵ . Lo sviluppo di infiammazione e fibrosi richiede un secondo insulto ^{6 , 7} o infusione intragastrica cronica, che è invasiva e tecnicamente impegnativa ^{8 , 9} . Il teleost zebrafish sviluppa anche lesioni epatiche in risposta sia al trattamento alcolico cronico che acuto ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15} . In particolare, il pesce zebra di larve rappresenta un attraente organismo modello complementare in cui studiare lesioni al fegato alcoliche acute ^{, 10 , 11 , 13 , 15} . Il fegato di zebrafish è funzionale e produce enzimi chiave per il metabolismo dell'etanolo da 4 giorni(Dpf) ^{13 , 16 , 17. L'} etanolo può essere aggiunto direttamente all'acqua e l'esposizione al 2% di etanolo per 24 ore è sufficiente a indurre steatosi epatica e risposte fibrogeniche nelle larve ^{13 e 15 dello} zebrafish.

È stato riportato che il trattamento con 2% di etanolo per 24 ore ha determinato una concentrazione di etanolo tessuto di 80 mM nelle larve ^{13 di} zebrafish. Altri hanno dimostrato che le larve tollerano questa concentrazione ei fenotipi epatici osservati negli animali trattati sono specifici per l'esposizione di etanolo ^{11 , 13 , 15 , 18} . Tuttavia, poiché 80 mM è quasi letale negli esseri umani ¹⁹ , è importante valutare l'istologia epatica del pesce zebra trattato con etanolo e rilevareDistruggere la rilevanza fisiologica dell'uomo.

Il rapido sviluppo esterno e la traslucenza delle larve dello zebrafish permettono di caratterizzare l'azione dell'alcool nel fegato in tempo reale e in campioni fissi. La disponibilità di linee transgeniche fluorescenti specifiche di tipo cellulare e dei recenti progressi nella microscopia confocale facilitano lo studio di come diversi tipi di cellule epatiche cambino la loro morfologia e il loro comportamento in risposta al trattamento acuto di etanolo 11,15. Tuttavia, l'imaging confocale dei pesci zebra transgenici fluorescenti non può completamente sostituire la colorazione di ematossilina e di Eosin (H & E) durante lo studio dell'istologia del fegato. Marcando tutti i tipi di cellule epatiche contemporaneamente utilizzando zebrafish transgenici richiede la generazione di singole linee transgeniche, ciascuna etichettatura di un tipo di cellule epatiche con un unico fluoroforo. Introdurre diversi sfondi transgenici nello stesso pesce richiede la razzaG generazioni multiple, che richiede tempo e sono costosi. È necessaria una colorazione immunofluorescenza aggiuntiva per rilevare componenti di matrice extracellulare. La colorazione H & E, invece, identifica contemporaneamente tutti i tipi di cellule epatiche e le componenti della matrice extracellulare, fornendo così una panoramica del fegato ²⁰ . Inoltre, rivela facilmente varie caratteristiche istopatologiche delle malattie epatiche, come la morte epatocitaria, la steatosi e la fibrosi. Anche se H & E è una macchia di routine nell'istologia del fegato mammifero, non è comunemente utilizzata nella ricerca epatica del zebrafish e il protocollo è meno ben definito.

Questo lavoro descrive un protocollo per il trattamento acuto di etanolo nelle larve di zebrafish e per le analisi istologiche di follow-up con la colorazione H & E. Il protocollo di colorazione H & E può essere utilizzato in tutti gli studi di sviluppo e funzionalità del fegato. Inoltre, le sezioni di paraffina possono essere utilizzate per immunohistochemistry, come pure per altri sta sta specialiIns nella patologia epatica, tra cui la macchia tricromica, la macchia di reticulina, ecc .