Medição da lipólise basal e estimulada por Forskolin em almofadas de gordura adiposa inguinal
概要
Este protocolo descreve o método de determinação da lipólise basal e estimulada com forscolina em almofadas de gordura inguinal obtidas a partir de dieta normal (NCD) ou dieta rica em gordura (HFD) ± capsaicina alimentada com camundongos de tipo selvagem. Como índice de lipólise, a libertação de glicerol foi medida a partir de almofadas de gordura adiposa inguinal.
Abstract
A lipólise é um processo pelo qual o lípido armazenado como triglicerídeos em tecidos adiposos é hidrolisado em glicerol e ácidos graxos. Este artigo descreve o método para a medição de lipólise estimulada basal e forscolina (FSK) nas almofadas de gordura inguinal isoladas de camundongos de tipo selvagem alimentados com dieta normal (NCD), dieta com alto teor de gordura (HFD) ou uma dieta rica em gordura contendo 0,01 % De capsaicina (CAP; agonista do subfamília Vanilloid do potencial de receptores transitórios 1 (TRPV1) durante 32 semanas. O método aqui descrito para a realização de lipólise ex vivo é adotado a partir de Schweiger et al. 1 Apresentamos um protocolo detalhado para medir os níveis de glicerol por espectrofotometria UV-Visível (UV / VIS). O método descrito aqui pode ser usado para isolar com sucesso as almofadas de gordura inguinal para medições de lipólise para obter resultados consistentes. O protocolo descrito para almofadas de gordura inguinal pode prontamente ser ampliado para medir a lipólise em outros tecidos.
Introduction
Os tecidos adiposos armazenam a energia como gordura 2 e a oxidação de ácidos gordos é necessária para a termogênese 3 , 4 . Os ácidos gordurosos ingeridos através de dietas são embalados juntamente com as apoproteínas em quilomicrons e entregues a diferentes tecidos no corpo através da circulação sanguínea. Embora a maioria das células no corpo armazene uma reserva de energia, o tecido adiposo armazena o excesso de energia como gordura 5 , 6 . A lipólise no tecido adiposo é regulada por processos complexos e os detalhes moleculares da lipólise ainda permanecem vagos 7 .
A lipólise é um processo pelo qual os triglicerídeos (TGL) armazenados em tecido adiposo são hidrolisados para produzir glicerol e ácidos graxos (FA) pela enzima lipidélio triglicerídeo adiposo (ATGL) 8 . As alterações na lipólise basal e estimulada são características da obesidade. O bA lipólise de asal é regulada pela ativação ATGL 9 , que converte TGL em diacilglicerol (DAG), que posteriormente é hidrolisado em monoacil glicerol (MAG). A ativação da lipase sensível a hormonas (HSL) via adenilil ciclase ativa a estimulação da proteína quinase A (PKA) dependente da adenosina cíclica (cAMP) e causa lipólise. A medição da lipólise, basal e estimulada, é, portanto, importante analisar a atividade das proteínas envolvidas neste processo. Além disso, desvendar a regulação molecular da lipólise pode ser benéfica para desenvolver novas estratégias terapêuticas contra a obesidade 10 . Uma vez que, moléculas que estimulam lipólise e oxidação de ácidos gordos são potenciais candidatos para a diminuição de gorduras armazenadas em depósitos, é importante empregar um ensaio robusto para a reprodutibilidade.
Dados anteriormente publicados sugerem que a ativação da proteína TRPV1 expressa em tecido adiposo branco por CAP reforçada basalE FSK (ativador de adenilil ciclase) – lipólise estimulada em almofadas de gordura inguinal 11 . Pesquisas anteriores também sugerem que a ativação a longo prazo de TRPV1 por CAP ativa a PKA 12 . Uma vez que a ativação da PKA estimula a lipólise 13 , 14 , a medição da lipólise estimulada basal e PKA estimulada nas almofadas de gordura inguinal isoladas de ratos NCD ou HFD (± CAP) após 32 semanas de alimentação, as dietas respectivas validarão o papel de TRPV1 Ativação na lipólise.
Este artigo descreve um método eficiente de determinação de lipólise basal e estimulada. Embora outros métodos que empregem isótopos radioativos de glicerol e cromatografia líquida tediosa de alta performance ou cromatografia gasosa / espectrometria de massa para medições 15 , 16 estejam disponíveis, esse método oferece um método mais direto, simples e econômicoTécnica para determinar lipólise em tecidos adiposos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O processo de degradação de TGL em glicerol e ácidos graxos é catalisado por ATGL 9 durante a lipólise basal e orquestrado por uma série de proteínas, incluindo a ativação da via adenilil ciclase / dependente de PKA durante a lipólise estimulada 21 , 22 , 23 . O aprimoramento da lipólise aumenta os níveis plasmáticos de ácidos graxos para transporte e uso de energia 24</su…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio AHA nº 15BGIA23250030, o Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais do NIH sob o número de prêmio 8P20 GM103432-12 e o Subsídio de Faculdade da Universidade de Wyoming em Aid to BT.
Materials
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
参考文献
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ. Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).
- Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).
- Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).
- Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).
- Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
- Langin, D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome. Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).
- Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis. Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).
- Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S., Greenberg, A. S. Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes. J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).
- Kolditz, C. I., Langin, D. Adipose tissue lipolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).
- Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms. Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).
- Yang, D., et al. Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension. Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).
- Ding, L., et al. Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity. Sci Rep. 6, 34374 (2016).
- Ohyama, K., et al. A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).
- Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer. J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).
- Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers. Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).
- Baskaran, P., et al. TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue. Int J Obes (Lond). , (2017).
- Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis. Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
- Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).
- Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).
- Jeppesen, J., Kiens, B. Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise. J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).
- Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids. Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).
- Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels. Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).
- Barbera, M. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell. J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).
- Leung, F. W. Capsaicin as an anti-obesity drug. Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).
- Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. Thermogenic ingredients and body weight regulation. Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).
- Kang, J. H., et al. Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet. Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).
- Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog. Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).
- Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes. Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).
