Hier presenteren we een procedure voor het uitvoeren van grootschalig Ca 2+ beeldvorming met cellulaire resolutie over meerdere corticale lagen in vrij bewegende muizen. Honderden actieve cellen kunnen tegelijkertijd worden waargenomen met behulp van een miniatuur kop microscoop gekoppeld met een geïmplanteerde prisma sonde.
In vivo circuit en cellulaire niveau functionele beeldvorming is een kritisch instrument om de hersenen in actie te begrijpen. Hoge resolutie beeldvorming van muiscorticale neuronen met twee-foton microscopie heeft unieke inzichten gegeven in corticale structuur, functie en plasticiteit. Echter, deze studies zijn beperkt tot hoofd vaste dieren, waardoor de gedragscomplexiteit die beschikbaar is voor studie sterk vermindert. In dit document beschrijven we een procedure voor het uitvoeren van chronische fluorescentiemicroscopie met cellulaire resolutie over meerdere corticale lagen in vrijgedragen muizen. We gebruikten een geïntegreerde miniaturiseerde fluorescentiemicroscoop die gepaard was met een geïmplanteerde prisma sonde om de calciumdynamiek van honderden neuronen tegelijkertijd over meerdere lagen van de somatosensaire cortex te visualiseren en op te nemen, aangezien de muis over enkele dagen in een nieuwe object exploratietaak betrokken was. Deze techniek kan worden aangepast aan andere hersenregio's in verschillende diersoorten voor andere gedragspatronenaradigms.
De cortex is een essentiële speler in veel complexe mentale en gedragsfuncties, van aandacht, zintuiglijke waarneming en top-down cognitieve controle 1 , 2 , 3 naar motivatie-, beloning- en verslavingsroutes 4 , 5 . Het begrijpen van de berekeningsprocessen die onder zijn functie staan, is een belangrijk doel om een beter klinisch begrip te krijgen van veel mentale en gedragsstoornissen.
Veel huidige theorieën van de psychiatrische ziekte concentreren zich op het idee dat corticale neurale circuits disfunctie of discoordinatie kan leiden tot cognitieve en gedragsafwijkingen die de kenmerken zijn van aandoeningen zoals schizofrenie 6 , autisme 7 of obsessieve-compulsieve stoornis 8 . Aldus, het verkrijgen van bevolkingsniveau neurale activiteit data van coRticale circuits binnen de juiste context van gelijktijdige gedragsinformatie is van groot belang en ideaal kan worden gericht op specifieke celtypen voor fijnere neurale circuit dissectie.
Miniaturized microscopen in combinatie met implanteerbare gradiëntbrekingsindex (GRIN) microlenses zorgen voor optische toegang tot neuronale ensembles onder vrij bewegende omstandigheden uit een verscheidenheid aan mogelijke hersengebieden 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , inclusief de cortex 14 , 15 , 16 . Het gebruik van een mobiel microscopiesysteem gekoppeld aan genetisch gecodeerde calciumindicatoren zorgt voor consistent beeldvorming van dezelfde cellulaire populatie die honderden neuronen over dagen tot weken in veel hersenregio's 9 omvat en kan zijnGenetisch gericht op specifieke celtypen met behulp van virale vector of transgene technieken.
Aangezien de cortex bekend is om verschillende functies te ondersteunen en te verbinden met verschillende hersengebieden afhankelijk van de locatie van de cellen binnen de corticale lamina 17 , 18 , 19 , zijn we geïnteresseerd in het verkrijgen van gelijktijdige multi-lags neurale activiteit bij wakker gedragen onderwerpen. Hier laten we zien hoe u honderden fluorescente gemerkte neuronen in vrije muizen over dagen kunt opnemen, met behulp van de geminomatiseerde fluorescentiemicroscoop 20 gepaard met een geïmplanteerde prisma sonde, die een multi-layer-weergave van de cortex biedt ( Figuur 1 ).
De hier gebruikte prismodule bestaat uit twee afzonderlijke GRIN-objectieven: een prisma en een cilindrische relaislens ( Figuur 1 ). Het licht van de microscoop stimuleert het fluorescente labelCellen die zich langs het beeldvlak van de prisma sonde bevinden, na af te zien van de hypotenus van het prisma gedeelte van de sonde. Het uitgestraalde licht van de cellen weerspiegelt ook de hypotenuse van het prisma, wordt verzameld door middel van de microscoop en bereikt de sensor in de microscoop. De in deze procedure gebruikte prisma sonde is aangepast voor eenvoudig gebruik met standaard stereotaxische apparatuur.
De geminiaturiseerde fluorescentiemicroscoop 20 detecteert actiepotentiaal-opgewekte Ca 2+ transiënten in neuronale populaties met enkele celresolutie, nadat die cellen specifiek zijn gemerkt met Ca 2+ -gevoelige genetisch gecodeerde fluorescentie-indicatoren. In dit protocol injecteren we Ca 2+ indicator die gecodeerd is in een virale vector (AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40), een prisma sonde implanteert, de microscoop installeert, dan meerdere dagen van somatosensorale (S1 achterste ledematen) neurale activiteit gegevens verkrijgen Van een dier blootstellenD tot nieuwe objectoppervlakken tijdens vrije exploratie ( Figuur 2 ).
Het begrijpen van neurale kringactiviteit tijdens wakker gedrag is een vitaal niveau van neurowetenschappelijk onderzoek dat nodig is om de hersenfunctie effectief in gezondheid en ziekte op te lossen. De cortex is een bijzonder belangrijk gebied om te studeren in het kader van wakker gedrag, omdat het een belangrijke rol speelt in vele vitale, cognitieve en uitvoerende functies 28 , 29 .
De corticale kolom wordt beschouwd als de basisfunctionele eenheid in de cortex en populatie-niveau activiteit van corticale cellen is bekend om te verschillen op basis van hun fysieke locatie binnen de kolom. Bijvoorbeeld, excitatoire neuronen in lagen 2/3 in de somatosensorische cortex projecten in hoofdzaak naar andere neocortische gebieden en moduleren andere corticale netwerken 30 , terwijl cellen in dieper lagen vooral naar subcortische gebieden zoals de thalamus 31 raken. Opnemen van de activiteit van honderdS van vooraf gespecificeerde corticale cellen tegelijkertijd en betrouwbaar over de tijd over verschillende lamina's in vrijgedragen onderwerpen, zou ons begrip voor de corticale informatiestroom sterk verbeteren, waardoor een fijnere functionele dissectie van corticale kolommen wordt geïnformeerd door real-time gedragsinformatie en taakrelevante tijd- schalen.
Het verzamelen van dit niveau van neurale kringsdata is mogelijk gemaakt door gebruik te maken van een efficiënt en gestroomlijnd miniaturiseerd microscopieplatform om grootschalig Ca 2+ beeldvorming in vrijgedragen onderwerpen (of hoofdonderwerpen zoals gewenst) uit te voeren. Gebruikt met genetisch gecodeerde calciumindicatoren om een specifiek targeting van cellen te activeren en een multi-lags gezichtsveld voor te stellen die wordt geleverd door een chronisch geïmplanteerde prisma sonde, onderzoekt dit protocol onder veel mogelijke toepassingen: observatie van laminaire verschillen in somatosensorische corticale verwerking bij muizen Fysiek verloofd met een nieuw object ( figuur 5 ).Dit is de eerste procedurele illustratie van dit soort celtype specifieke, in vivo aanpak om meerdere corticale lagen te bestuderen bij wakker, vrij gedragen dieren en verbrengt het spectrum van experimentele methoden die beschikbaar zijn om laminaire structuren in de actieve hersenen te begrijpen.
Het periscopische zichtveld dat door de prisma sonde in deze techniek wordt geactiveerd, kan haalbaar toegepast worden op andere hersenstructuren wanneer het behoud van het weefsel direct dorsaal naar een gebied van belang is gewenst; Bijvoorbeeld, CA3 beeldvorming kan worden bereikt zonder verstoring van de hippocampale functie.
Prism sonde gebaseerde aanpak voor imaging Ca 2+ activiteit vereist de fysieke invoeging en permanente implantatie van een microprism in de cortex, die overeenkomt met de creatie van een corticale letsel waar de lens sonde wordt geplaatst. Dit kan leiden tot verstoringen van de lokale neurale schakeling, met inbegrip van de afscheiding van apische dendrieten en processen. TZijn procedure zal ook een initiële activering van glialcellen in het gebied veroorzaken, alhoewel dit naar verwachting wordt gelokaliseerd aan het weefsel ongeveer 150 μm van het prisma-gezicht en om te dalen nadat de hersenen 22 genezen hebben. Het is zeer belangrijk om te overwegen of deze techniek de normale anatomie en / of gedrag van de dieren beïnvloedt bij het plannen van experimenten. Gedragsgroepen moeten altijd worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat er geen significante veranderingen zijn in het basisgedrag dat kan leiden tot confounding experimentele resultaten.
Met behulp van deze miniaturiseerde, mobiele Ca 2+ beeldvormingstechniek met neurofarmacologische manipulatie, verschillende cognitieve, sociale, motorische of intrinsieke gedragsparadigma's, en het combineren met andere fysiologische metrischen kunnen de studies worden verdiept en verrijkt die gericht zijn op het begrijpen van de functionele rollen van neurale schakelingen in gedrag en signaal Verwerking 32 . Onderdrukking of actiefAtion van bepaalde pathes, gemoduleerd door drugs, kan bijbehorend gedrag beïnvloeden, die gemakkelijk met deze technologie kan worden bestudeerd 33 . Uitbreiden in verschillende celtypes door de targeting van de calciumindicator te wijzigen is een andere krachtige en handige applicatie, en maakt het mogelijk om veel creatieve combinaties van experimentele hulpmiddelen aan te passen aan diverse neurale schakelvragen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken V. Jayaraman, DS Kim, LL Looger en K. Svoboda van het Genetisch-Gecodeerde Neuronale Indicator en Effector (GENIE) Project op Janelia Research Campus van het Howard Hughes Medical Institute voor hun royale donatie van AAV1-GCaMP6f Naar de Universiteit van Pennsylvania Vector Core. Zij willen ook de A. Olson en Neuroscience Microscopy Core aan de Stanford University bedanken, ondersteund door NIH NS069375 subsidie voor hun confocale microscopiediensten.
Neurostar Motorized Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument |
Kopf | Model 963SD | Surgery |
Stereoscope | Labomed | Prima DNT | Surgery and Imaging |
Mini Rectal Thermistor Probe (.062"/1.6mm diameter) – 1/4" Jack | FHC | 40-90-5D-02 | Surgery |
Heating Pad 5 X 12.5cm | FHC | 40-90-2-07 | Surgery |
DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | Surgery |
Microsyringe Pump | World Precision Instruments | UMP3 model; serial 155788 F110 | Surgery |
NanoFil 10μL Syringe | World Precision Instruments | NANOFIL | Surgery |
35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK | World Precision Instruments | NF35BV-2 | Surgery |
Omnidrill35, 115-230V | World Precision Instruments | 503598 | Surgery |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
nVista | Inscopix | 100-001048 | Imaging |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-1-PV3435 | Surgery |
Ketoprofen | Victor Medical | 5487 | Surgery |
Carprofen | Victor Medical | 1699008 | Surgery |
Isoflurane | Victor Medical | 1001054 | Surgery |
Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12cmx7mm) | Pfizer (Fisher Scientific) | NC9841478 | Surgery |
Dumont #5/45 forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Surgery |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Surgery |
Dissecting knives | Fine Science Tools | 10055-12 | Surgery |
ProView Implant Kit | Inscopix | 100-000756 | Surgery and Imaging |
ProView Prism Probe 1.0mm-Dia. ~4.3mm Length | Inscopix | 100-000592 | Surgery and Imaging |
Kwik-Sil adhesive pack of 2 | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Surgery |
Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Surgery and Imaging |
Miniature Optical Mounting Post | Newport | M-TSP-3 | Imaging |
Microscope Baseplate | Inscopix | BPL-2 | Imaging |
Microscope Baseplate Cover | Inscopix | BPC-2 | Imaging |