Metabolic Kompetenz von in vitro – Systemen ist eine wesentliche Voraussetzung für die Biotransformation und Disposition von Drogen und Giften. In diesem Protokoll beschreiben wir die Anwendung von Referenzstoffwechselsonden Phase I in Zellkulturen des Stoffwechsel zu bewerten.
Xenobiotika metabolisierenden Enzyme spielen eine Schlüsselfunktion bei der Biotransformation von Arzneimitteln und Giften durch funktionelle Gruppen hinzufügen, die Löslichkeit zu erhöhen und die Ausscheidung erleichtern. In einigen Fällen führen diese strukturellen Änderungen an der Bildung neuer toxische Produkte. Um Tierversuche zu verringern, kann unter Verwendung von chemischem Risiko metabolisch kompetente Zellen beurteilt werden. Die Expression von Stoffwechselenzymen, ist jedoch nicht über längere Zeit stabil in viele in vitro primären Kultursystemen und ist oft teilweise oder nicht vorhanden in Zelllinien. Daher soll die Studie von Arzneimitteln, Additiven und Umweltschadstoffe Stoffwechsel in vitro idealerweise in Zellsystemen durchgeführt werden , in denen die Stoffwechselaktivität gekennzeichnet ist. Wir erklären hier einen Ansatz mit der Aktivität einer Klasse von Stoffwechselenzymen zu messen (Human Phase I) in 2D-Zelllinien und Primär 3D-Kulturen unter Verwendung von chemischen Sonden und deren Stoffwechselprodukte quantifizierbare von UPLC-Massenspektrometrie undLuminometrie. Das Verfahren kann die Stoffwechselaktivität in Zelllinien und primären Zellen, die aus einer Vielzahl von Geweben zu testen abgeleitet implementiert werden.
Xenobiotischen Stoffwechsel ist der Prozess , durch die Chemikalien körperfremd durch die Zugabe von hydrophilen Gruppen modifiziert sind und Konjugate ihre Ausscheidung 1 zu erleichtern. Typischerweise ist der Metabolismus von Xenobiotika ein zweistufiges Verfahren mit der Phase I mit der Zugabe von einem oder mehreren Hydroxylgruppen 1, 2 hauptsächlich aus einer Oxidations bestehen. In Phase II werden die Hydroxylgruppen verwendet , wie für ein hydrophiles Konjugat wie Glucuronid Akzeptoren oder eine Sulfateinheit 1, 2. Wenn eine Akzeptor-Gruppe auf den Molekülen bereits vorhanden ist, kann die Konjugation Schritt unabhängig von Stoffwechsel Phase I geschehen. Jede Reaktion wird durch eine spezifische Gruppe von Enzymen durchgeführt, beispielsweise CYPs (Cytochrom P450), die die Hydroxylierung (Abbildung 1) und Dealkylierung von chemischen Substrate 3 katalysieren. Conjugation wird durch Sulfotransferasen katalysiert, UDP-Glucuronosyltransferasen (Abbildung 1), Glutathion-S-Transferasen und N-Acetyltransferasen 4. Jedes Gewebe und Organ wird ein spezifisches metabolisches Enzym Expressionsprofil aufweisen, mit der Leber die meisten dieser Proteine exprimieren.
Abbildung 1: Beispiel für Phase I und Phase II Metabolismus für Cumarin. CYP2A6 / CYP2A13 die 7-Hydroxylierung von Cumarin katalysieren. 7-Hydroxycumarin wird von Phase-II-Enzyme zu einer UGTs Glucuronidteil konjugiert mit UGT1A6 und UGT1A9 der höchsten Aktivität zeigen.
den Metabolismus von Xenobiotika zu verstehen, ist bei der Beurteilung der Arzneimittelsicherheit und Risikobewertung von Chemikalien aus zwei Gründen entscheidend: die Reaktionskinetik wird bestimmen, wie lange ein Medikament oder Chemikalie im Körper in einer aktiven oder inaktiven Form b bleibenefore Ausscheidung; und die Ausgangsverbindung kann durch metabolische Enzyme zu einer reaktiveren, instabiler und toxischen Spezies modifiziert werden. Solche Reaktionen auch als „Bioaktivierung“ bekannt sind , vor allem von der Phase I CYP – Enzym angetrieben , sondern auch von selteneren Fällen von Phase II Konjugation 5.
Auf dieser Grundlage ist die Fähigkeit eines で – vitro – Modell , um genau das Risiko mit einem Medikament oder einer Chemikalie ist stark abhängig von der Stoffwechsel Kompetenz des Zellsystems assoziiert vorherzusagen. Zelllinien , die von erkranktem Gewebe oder aus der Transformation von normalen Zellen verlieren oft Teil , wenn nicht alle des metabolischen Enzymprofil repräsentativ für ihre Ursprungsgewebe 6. Die Aufrechterhaltung des normalen Stoffwechselenzymprofiles erscheint besser in primären Zellkulturen (zumindest in kurzen Zeitkulturen) und wird weiter verbessert , wenn das Gewebe in einer Matrix kultiviert wird , so dass sie ihre 3D – Struktur 1 zu halten. Daher ist die charrakterisierung der metabolischen Kompetenz eines in vitro – Zellsystem ist eine wichtige Vorstufe für die Entscheidung in Bezug auf das Führungszellenmodell geeignet ist , chemische Sicherheitsbewertungen durchzuführen.
In diesem Papier präsentieren wir ein Protokoll , um die Aktivität und Expression von Phase – I – CYP – Enzymen in vitro mit Beispielen ihrer Anwendung mit einer hepatischen Zelllinie 7 und 3D primären Lungenzellkulturen 8 zu profilieren. CYP spezifische Substrate, deren Stoffwechselprodukte und Inhibitor-Kontrollen werden zusammen mit Masse spectrometry- und luminogene basierten Quantifizierungsmethoden beschrieben. Da einige CYPs induzierbaren sind und andere sind konstitutive, Beispiele werden auch für diese beiden Szenarien gegeben werden.
Viele standardisierten toxikologischen Testsysteme verwenden Engineered Bakterien, Zelllinien oder Embryonalzellen Derzeit , die nicht repräsentativ für den normalen menschlichen Stoffwechsel 1 sind. Dies kann zu einem ungenauen Vorhersage der potentiellen toxischen Aktivität eines chemischen oder Medizin führen. Innovative で – vitro – Modelle, wie etwa 3D – Zellkulturen und Organ auf einem Chip, werden in einem Versuch entwickelt , um die normale Morphologie und die metabolische Aktivität von menschlichen Geweben 21, 22, 23 besser zu replizieren. Metabolic Kompetenz ist ein Kriterium, das verwendet werden kann, zu entziffern, welche Modelle am besten geeignet sind für die toxikologische Bewertung und Drogen Biotransformation Studien.
Das Protokoll wir in diesem Papier skizziert haben, ist entworfen, um die Aktivität von CYP-Enzyme unter Verwendung von lebenden Zellen zu messen. Es ist flexibel und kann für verschiedene Zellsysteme in 2D- oder 3D-cultur verwendet werdenes bietet die Möglichkeit, entweder eine luminogener Sonden- oder einen Massenspektrometrie-basierten Ansatz zu verwenden. Beiden Verfahren sind empfindlich genug, um Nanogramm-Mengen von Materialien zu erkennen und nur eine kleine Anzahl von Zellen in einem Multi-Well-Format gezüchtet erfordern. Sie können auch auf spheroid oder Zellen in komplexen Matrices gewachsen angewendet werden. Die Auswahl des Sondensubstrat ist natürlich ein wichtiges Element des Protokolls. Die Spezifität des Assays beruht auf der selektiven Sonde des CYP Enzym und einer weiteren Schicht aus Sicherung sein kann durch die Verwendung eines selektiven Inhibitors CYP erhalten werden. Die Substrate und Inhibitoren in diesem Dokument aufgeführt sind nur einige Beispiele, aber andere können in der Literatur gefunden werden.
Es ist wichtig, mehrere Inkubationszeiten zu berücksichtigen, wenn mit einem neuen Zelltyp als negatives CYP Aktivität Ergebnis arbeiten könnte durch das Enzym auf einem niedrigen Niveau exprimiert werden. Die Zugabe eines Zelltypen, der als positive Kontrolle verwendet werden kann, wird empfohlen, dass ein, um sicherzustellen,negatives Ergebnis ein technisches Problem nicht verknüpft und mit jeder Fehlersuche zu helfen. Primäre Leberzellen metabolisch kompetent sind und können als Kontrolle verwendet werden, beispielsweise primären Hepatocyten in Suspension ist sehr einfach zu verwenden, aber ihre Lebensfähigkeit ist zeitlich begrenzt. Leberzelllinien sind mögliche Alternativen , die relativ einfach sind , wie in diesem Protokoll zu verwenden, aber einige sind besser als andere in Bezug auf die metabolische Aktivität 6, 21.
Da der Test nicht zerstörend ist, es sei denn , Gesamtprotein quantitativ bestimmt wird, ist es möglich , die CYP – Aktivität im Laufe der Zeit in Langzeitstudien 20 zu folgen. Dies ist ein wichtiger Punkt, da einige Zellen variable CYP Aktivität im Laufe der Zeit in der Kultur haben. Ein negatives Ergebnis könnte mit dem Mangel an Konfluenz, Fortschritten bei der Differenzierung oder Dedifferenzierung in vitro in Verbindung gebracht werden. In diesem Fall ist der Ansatz, halb quantitative, da die Daten nicht von der Gesamtmenge an Protein in jeder Zellkultur normiert sind. Es ist nicht immer möglich oder empfohlen, das Gewebe nach der Messung der CYP Aktivität als Exposition gegenüber Sonden, Inhibitoren oder Induktoren zur Wiederverwendung kann eine toxische Wirkung auf dem Gewebe hat, wie der Fall für TCDD ist.
Zellfraktionen wie Mikros könnte auch die CYP Aktivität eines gegebenen Zelltyp zu charakterisieren, verwendet werden. Mikrosomenzubereitungen erfordern jedoch eine Menge von Zellmaterial, die Zugabe von ausreichenden Cofaktoren und Puffer, um sicherzustellen, dass die Enzyme aktiv bleiben. lebende Zellen unter Verwendung entfällt den schwierigen Mikrosvorbereitungsschritt und ausarbeitet, welche Puffer und Cofaktoren am besten funktionieren.
Als allgemeine Empfehlung ist es eine bewährte Methode, das Expressionsprofil von CYP in Zellkulturen weiter zu charakterisieren, um sicherzustellen, dass sie die enzymatische Aktivität entspricht. Diese zusätzliche Ebene der Überprüfung wird empfohlen, da die Stoffwechselsonden sind nicht ENTIauf eine einzelne CYP verlassen spezifischen und erhöhte Sicherheit gibt, dass die gemessene metabolische Aktivität durch das entsprechende Enzym-Expression angepasst ist. Da CYPs Membranproteine sind , sind sie relativ schwer für Western – Blots herzustellen, deshalb quantitative RT-PCR der bevorzugte Ansatz wurde 20 diese Enzyme profilieren.
Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll, ein Verfahren zum Test CYP-Enzymaktivität beschreibt, die nur eine Familie von Stoffwechselenzymen dar, wenn auch ein wichtiger. Die Flexibilität eines Massenspektrometrie-Ansatz ermöglicht die Entwicklung von Erfassungsmethoden für andere metabolische Transformationen von Sondensubstraten. diejenigen haben werden jedoch einen nach dem anderen entwickelt und es gibt derzeit weniger bekannte spezifische Sonden und selektive Inhibitoren für andere metabolische Enzymfamilien. Diese Lücke sollte für eine umfassende Beurteilung der metabolischen Kompetenz der で – vitro – Zell Syste zu ermöglichen , werden angesprochenFrau.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Epithelix Sarl and Biopredic International for providing the airway cells and hepatic cells micrographies and Neil Smith for the figure illustrating the experimental procedure.
Reagent & Cells | |||
2 μm syringe filter | Whatman | UN203NPEORG | |
24 well plate | Corning | 3524 | |
4-methylumbelliferone | Sigma Aldrich | M1381 | |
5-phenyl pentyne | Sigma Aldrich | CD5001437 | |
6-hydroxybupropion | Sigma Aldrich | H3167 | |
6-hydroxychlorzoxazone | Sigma Aldrich | UC148 | |
7-ethoxycoumarin | Sigma Aldrich | 195642 | |
7-hydroxycoumarin | Sigma Aldrich | H24003 | |
8-methoxypsoralen | Sigma Aldrich | M3501 | |
acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
acetonitrile | Fisher | A/0626/17 | |
α-naphthoflavone | Sigma Aldrich | N5757 | |
BCA kit | Thermo Scientific | 23227 | |
b-glucuronidase/arylsulfatase | Sigma Aldrich | G0876 | |
Bupropion | Sigma Aldrich | B102 | |
Carbamazepine | Sigma Aldrich | C4024 | |
chlorzoxasone | Sigma Aldrich | C4397 | |
collagen | Cell Systems | 5005-B | |
coumarin | Sigma Aldrich | C4261 | |
disulfiram | Sigma Aldrich | 86720 | |
fluvoxamine | Sigma Aldrich | F2802 | |
Glutamax (Glutamine supplement) | Fisher | 35050061 | |
HepaRG metabolism supplement | Merck | MMAD621 | |
HepaRG thaw media supplement | Merck | MMADD671 | |
HepaRG | Merck | MMHPR116 | |
Luciferin-CEE | Promega | V8751 | |
methanol | Fisher | M/4056/17 | |
MucilAir airway cells | Epithelix | EP01 | |
MucilAir airway cells maintenance media | Epithelix | EP04MM | |
Phenomenex Kinetex 2.6μm, PFP 100A | Phenomenex | 00B-4477-AN | |
TCDD | Sigma Aldrich | 48599 | |
thioTEPA | Sigma Aldrich | T6069 | |
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8µm 2.1 x 50mm | Waters | 86003538 | |
Williams’ E media | Fisher | 17704-024 | |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Equipment | |||
UPLC | Waters | Acquity | |
QTRAP MS | Sciex | ABI Sciex 4000 | |
QTRAP MS software | Sciex | Analyst 1.4.2 | |
luminometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax M3 | |
cell counter | Beckman Coulter | Vi-Cell XR | |
rotary evaporator | Eppendorf | Eppendorf-5301 |