Dissection von Larval Zebrabärbling Gonadal Tissue

Das wichtigste weibliche Geschlecht Determinante bei Wild Zebrabärbling Chromosom 4 in dem domestizierten Zebrabärbling (dh gemeinsame Laborstämme) ¹ verloren oder verändert werden . Stattdessen haben sie eine polygene System Geschlechtsbestimmung durch Umweltfaktoren wie Temperatur begleitet, Hypoxie, Nahrungsverfügbarkeit und Bevölkerungsdichte. Die detaillierten Mechanismen der Zebrabärbling Geschlechtsentwicklung sind nicht vollständig verstanden. Grundsätzliche Fragen wie bei Zebrabärbling Geschlechtsbestimmung stattfindet, was das primäre Geschlechtsbestimmungssignal (s) ist / sind, und die Gene regulieren , der erste Schritt der Transformation Gonade bleibt ² beantwortet ^{werden, 3.}

Im Prozess der Zebrabärbling Geschlechtsentwicklung wurden mehrere wichtige Etappen anerkannt. In der frühen Phase der Entwicklung, ausgehend von 4 HPF (Stunden nach der Befruchtung) Ur-Keimzellen (PGC) unterzieht Spezifikation, die Migration zu Genitalleiste undProliferation. PGC Zahlen und gegenseitige Wechselwirkungen zwischen den Keimzellen und somatischen Zellen sind wichtig für die Gonade Differenzierung ^4. Bei 13 dpf (Tage nach der Befruchtung), sind die Gonaden in dem undifferenzierten Stadium. Mit dem 17 dpf, entwickeln die Gonaden in bi-Potential Ovarien in beiden zukünftigen Frauen und Männern. Der Apoptose-abhängiger Übergang von Ovar zu Hoden bei 21 bis 25 dpf beginnen und für mehrere Wochen andauern kann. Von 35 dpf, hat das Geschlecht der Gonaden bestimmt worden , und geschlechtsspezifische Gameten Produktion ist im Gang in beiden Ovarien und Hoden ^{5, 6, 7.}

Bis heute diverse Kandidaten-Gene und Mechanismen der Geschlechtsbestimmung vorgeschlagen worden. Proteomics und Transkriptom – Analyse haben viele Gene mit geschlechtsdimorphischen Ausdruck und diese Gene wurden verwendet , um zu studieren Geschlechtsdifferenzierung in Zebrabärbling ^{8 isoliert,} </sup> ^{9, 10.} Zum Beispiel in larvalen Zebrabärbling wird das cyp19a1a Gen im Ovar spezifisch exprimiert , nicht aber in den Hoden ^{11, 12.} Zusätzlich wird AMH Gene schwach in den Ovarialfollikel Granulosa – Zellen exprimiert, aber stark in Testis Sertoli – Zellen ^13. Im Gegensatz dazu wird vasa – Gen in den Keimzellen des weiblichen und männlichen Zebrafisches, so dass es eine geeignete Gonade Marker ^{14, 15} kontinuierlich ausgedrückt.

Gonaden – Genexpressionsniveau zu untersuchen ist kritisch , den molekularen Mechanismus der Geschlechtsbestimmung und Differenzierung vor allem in der Bipotential-Ovar Stufe ^{3, 9} zu verstehen. Jedoch erschwert die geringe Größe der larvalen Zebrabärbling und entsprechend kleiner Gonaden die Isolierung von gonadal Gewebe für die weitere molekulare Analyse. Frühere Studien verwendet sezierten gesamten Rumpfbereich zwischen Opercula und anal Pore ^16. Diese Zubereitung, obwohl enthält Gonaden, besteht aus mehreren Geweben und Organen. Alternativ können transgene Tiere mit GFP Gonade spezifische Expression, wie vasa: ^{17, 18} EGFP wurden Gonadengewebe Trennung über Fluoreszenz – aktivierte Zellsortierung (FACS) und Laser – Capture – Mikrodissektion verwendet. Aber ihre weit verbreitete Anwendung ist begrenzt. Hier beschreiben wir ein einfaches Verfahren Gonadengewebe von Larven Zebrabärbling zu isolieren, auf 17 dpf und 25 dpf. Wir zeigen die Lage der Gonaden mit Bezug auf andere Organe und zu isolieren, die morphologisch intakten Gonaden aus den umgebenden Geweben. Wir zeigen weiter die Gonade spezifische Gene wie vasa und cyp19a1a sind in den isolierten Gonaden hochexprimierten verglichen mit dem Stamm Gewebe durch quantitative PCR (qPCR-Analyse). Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung, Isolierung, Reinigung und RNA – Amplifikation von Gonaden – spezifische Gene von larvalen Zebrabärbling, wodurch nachfolgende molekulare Analyse von Gonadengewebe ¹⁹ ermöglicht.