概要

Neurologische Reflex Testing in de neonatale rat Pups

Published: April 24, 2017
doi:

概要

Behavioral testen is de gouden standaard voor het bepalen van de resultaten na hersenletsel, en kan de aanwezigheid van ontwikkelingsstoornissen bij zuigelingen en kinderen te identificeren. Neurologische reflexen zijn een vroege indicator van deze afwijkingen. Een groot aantal eenvoudig te realiseren ontwikkelingsstoornissen reflex testen in de neonatale knaagdieren werden ontwikkeld en beschreven.

Abstract

Neurologische reflex testen wordt vaak gebruikt in de klinische praktijk om de rijping van het zenuwstelsel te beoordelen. Neurologische reflexen ook wel primitieve reflexen. Ze zijn gevoelig en in overeenstemming met latere uitkomsten. Abnormale reflexen worden beschreven als een afwezigheid, persistentie, opnieuw verschijnen of latentie reflexen, voorspellende indices van kinderen die een hoog risico op neurologische aandoeningen. Diermodellen van neurologische handicap, zoals hersenverlamming, vertonen vaak afwijkende ontwikkelingsstoornissen reflexen, zoals in de menselijke baby's zouden worden nageleefd. De beschreven technieken in diverse neurologische reflexen in neonatale ratten. Neurologische reflex testen biedt de onderzoeker een testmethode die anders niet beschikbaar in zulke jonge dieren. De hier gepresenteerde methode is bedoeld om onderzoekers te helpen bij het onderzoeken van mijlpalen in de ontwikkeling van pasgeboren ratten als een methode voor het detecteren early-onset brain letsel en / of het bepalen van de effectiviteit van therapeutische interventies. De hier gepresenteerde methodologie is erop gericht om een ​​algemene richtlijn voor onderzoekers.

Introduction

Neurologische reflexen, of mijlpalen in de ontwikkeling, zijn een van de vroegste evaluaties gebruikt op menselijke pasgeborenen en zuigelingen. Neurologische reflexen onwillekeurige en herhaalde bewegingen die hersenstam en ruggenmerg reflexen te tonen. Rijping van hogere corticale netwerken gekenmerkt door zich ontwikkelende migratie, myelinisatie en synaptogenese bevorderen willekeurige controle en corticale inhibitie. Veranderingen in het normale verloop van het centrale zenuwstelsel evolutie kan verstoren ontwikkeling van de hersenen, wat resulteert in abnormale corticale bedrading, functioneren en myelinisatie, waardoor neurologische reflex vertragingen of afwezigheid. Human zuigelingen met een hoog risico op neurologische handicap, worden vaak abnormaal vroege reflexen. Abnormale reflexen kunnen presenteren als een vertraging in aankopen, afwezigheid, langdurige aanwezigheid of terugkeer later in het leven, en zijn voorspellend ontwikkelingsstoornissen. 1, 2 Daarom, Is het belangrijk om reflex vertragingen in experimentele modellen van neurologische handicap na te bootsen.

Knaagdieren worden gewoonlijk gebruikt als experimentele modellen. Rat pups altricial toen geboren, en dus te onvolwassen aan specifieke of complexe motorische, zintuiglijke en / of cognitieve gedragstherapie taken uit te voeren. In dit opzicht hun ontwikkelings onvolwassenheid heeft betrekking op zowel hun fysieke en orgel ontwikkeling. Ratten zijn geboren haarloze met een onvermogen om thermoregulate, zijn blind, en niet in staat om te lopen. Verwijzend naar hersenontwikkeling aanzienlijke corticale rijping plaatsvindt postnataal. Pasgeboren ratten (dag van de geboorte aangeduid als postnatale dag 1; PD1) zijn voorgesteld om een ​​ontwikkeling van het brein niveau dat vergelijkbaar is met een premature menselijk brein van 23 te bereiken – 28 weken zwangerschap, terwijl PD7-10 pups zijn gelijkwaardig aan near- menselijk brein termijn. 3, 4, 5, 6Deze correlatie is gebaseerd op bruto anatomische analyses echter andere maatregelen van het brein zoals myelinisatie en amplitude geïntegreerd electroencephalograms zijn eveneens beschreven. 5, 7 bijvoorbeeld, pre-oligodendrocyten zijn de belangrijkste cellen in het ontwikkelende menselijke foetale hersenen 23-32 weken in utero en maturatie dit stadium correspondeert met een PD1-3 knaagdieren. 5, 8, 9, 10 Bovendien myelinisatie begint in utero bij mensen terwijl bij jonge ratten blijkt in de voorhersenen rond PD7-10; de pasgeborene knaagdierenbrein blijft grotendeels un-gemyeliniseerde. 11, 12 Tucker et al. gevonden dat de amplitude geïntegreerde elektro patroon van een P1 rat te vergelijken met een 23 weken zijn gestatie menselijke foetus, terwijl een PD7 en PD10 pup is te vergelijken met een 30-32 week en termijn zuigeling, respectievelijk. 7 Om deze redenen, pasgeboren reflex testen in de neonatale rat pups biedt een mogelijkheid voor het vastleggen van de ontogenie en / of verstoring van de ontwikkeling van de hersenen.

De batterij reflexen hieronder beschreven zijn afgeleid van studies van WM Fox en A. Lubics 13, 14 WM Fox was een van de eerste onderzoekers met betrekking tot de ontogenie van reflexen in de muis. 13 Deze reflexen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, ledematen grijpen en plaatsen, klif vermijding, rechtzetten, versnelde rechtzetten, gang, auditieve schrikreactie, houding en opening van de ogen. Zowel voorpoot en achterpoot greep (hierna handpalm en plantaire greep bij de mens, respectievelijk) worden vergemakkelijkt door spinale reflexen en corticospinal remming van niet-primaire motorische gebieden. 15, 16 achterbeen plaatsing (voetzoolreflex) weerspiegelt rijping van de corticospinal darmkanaal. 16, 17, 18 Cliff vermijden (beschermende responsen) oprichten (doolhof) en versnelde oprichten omvatten integratie en communicatie tussen sensorische input en motoruitgang (zoals die betrokken zijn bij de vibrissae en vestibulaire systemen). 19, 20, 21 Gait weerspiegelt motoriek. 14 Auditieve schrikreactie beoordeelt akoestische stimulatie en synaptische verbindingen van grote neuronen in de nucleus reticularis pontis caudalis. 21 houding impliceert geschikte corticale-spinale / spinale-corticale uitsteeksels, spierkracht en neuromusculaire innervatie. 22, 23 Maturation van het gamma-aminoboterzuur receptoren correleren met eye opening. 24 Het is belangrijk om in gedachten te houden dat de reflexen weerspiegelen een veel ingewikkelder netwerk en die hier is een algemene correlatie. Bovendien zijn deze reflexen zorgen voor een snelle en eenvoudige methode voor het beoordelen van de neurologische ontwikkeling op zeer jonge leeftijd, waar meer complexe gedragsproblemen testen is niet haalbaar.

Het doel van dit document is een algemene richtlijn voor neurologische reflextesten die gemakkelijk in neonatale ratten experimentele studies opgenomen kan worden. De beschreven methode werd uitgevoerd in Long-Evans neonatale ratten uitgevoerd en kwantificering van de resultaten was gebaseerd op de eerste dag van verschijning. De dag dat het testen reflex wordt geïnitieerd en de gebruikte apparatuur kan worden aangepast om beter bij een ander experimenteel model (zoals verschillende stammen en species). Hiertoe werd het normale fysiologische progressie van reflex rijping in een bepaald diermodel, kunnen onderzoekers de effecten van externe stressoren, endogene manipulaties en / of therapeutische ingrepen op neurodevelopment neonatale ratmodellen evalueren. Kortom, het gebruik van reflexen als een bepaling van hersenrijping voordelig bij het voorspellen perinatale hersenletsel en weerspiegelt latere neurologische resultaten.

Protocol

De Animal Care en gebruik Comite, Health Sciences aan de Universiteit van Alberta keurden alle dierproeven. Noot: Hoewel dit protocol kan worden aangepast aan andere soorten en stammen, wordt dit protocol geschreven Long-Evans ratten. Deze ratten bleken superieur motor prestaties en gezichtsscherpte in vergelijking met andere knaagdieren stammen. 25 26 Het protocol voor getimede zwangerschappen, voedingssupplementen, moe…

Representative Results

De tijdlijn van het experimentele ontwerp is weergegeven in figuur 2. 30 De methoden en resultaten zijn eerder gepubliceerd. 30 Het doel van de studie was om te beoordelen of aanvulling van de voeding met broccoli spruiten tijdens de dracht en het spenen periode beschermd de nakomelingen van neurologische vertraging veroorzaakt door in utero blootstelling aan LPS. Getimede drachtige ratten…

Discussion

Neurologische reflextesten de voorspellende maatstaf van abnormale corticale ontwikkeling en rijping, die van belang onder omstandigheden waarin openlijke neuropathologie niet evident zijn. Tijdens neurologische testen, is het essentieel om te waarborgen dat pups tegelijkertijd dagelijks onderzocht. Ratten zijn nachtdieren en daarom kunnen hun circadiane ritme prestaties veranderen als het testen wordt uitgevoerd op verschillende tijdstippen gedurende de dag. 34 Tests moeten in een rustige kamer …

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen onze financiering agentschappen, die NeuroDevNet (een Nationaal Centers of Excellence) onder meer dank, de ALVA Foundation, de Women's en Children's Health Research Institute, en de Universiteit van Alberta.

Materials

Breeding
Transfer pipettes Fisherbrand 12-711-9AM Used for vaginal flushes.
Sterile Saline Hospira 7983254 The solution used to collect cells during vaginal flushes.
400 µl Microcentrifuge tubes Fisherbrand 05-408-120 Used to hold the saline solution.
Light microscope Leica Leica ATC 2000 For observation of the saline solution. Can be any light microscope used in the lab.
Slides Fisherbrand 12-552-5 The saline solution is placed on the slide. Can be any slides used in the lab.
Coverslips Fisherbrand 12-545-F To coverslip the slides. Can use any coverslips used in the lab.
Dietary  Supplementation
Broccoli Sprouts seeds Mumm's Sprouting Seeds Broccoli sprouts seeds are ordered and grown in the lab.
Countertop Seed Sprouter Box Mumm's Sprouting Seeds A box is used to germinate and grow the seeds prior to harvest.
250 mL beaker The beaker is used to soak the seed. Any size beaker that would fit can be used.
Maternal Inflammation
Lipoplysaccharide (LPS) Sigma L3129 The endotoxin used to mimic maternal inflammation.
1 mL Syringe BD Syringe 309659 Used to inject the pregnant rat.
Gauge (30G X 1/2) BD PrecisionGlide Needle 305106 Use the smallest needle to avoid pain and discomfort.
Sterile Saline (0.9% Sodium Chloride, USP) Hospira Saline is used to dissolve LPS.
Weights
Scale Denver Instrument For recording the weights. Can be any scale with 2 decimal places used in the lab.
Neurodevelopmental Reflexes
Thin blunt rod Can be a paperclip or toothpick. This is for forelimb and hindlimb grasping.
Round filter paper Whatman 1001 150 15 cm diameter paper used for gait analysis.
Timer Fisher Scientific 06-662-51 For timing the time allocated to righting and gait.
Blunt surface Can be an edge of a table. This is for hindlimb placing and cliff avoidance.
Foam landing For when the pups perform accelerated righting.
Video recorder Sony VCT-D580RM To record all reflexes tested. Must be able to record at 1/1000 fps
Bell For auditory startle. 
Heat lamp or pad To maintain the body temperature of the pups underoing examination.

参考文献

  1. Farber, J. M., Shapiro, B. K., Palmer, F. B., Capute, A. J. The diagnostic value of the neurodevelopmental examination. Clin Pediatr (Phila. 24 (7), 367-372 (1985).
  2. Zafeiriou, D. I. Primitive reflexes and postural reactions in the neurodevelopmental examination). Pediatr. Neurol. 31 (1), 1-8 (2004).
  3. Clancy, B., Finlay, B. L., Darlington, R. B., Anand, K. J. S. Extrapolating brain development from experimental species to humans. Neurotoxicology. 28 (5), 931-937 (2007).
  4. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Hum. Dev. 3 (1), 79-83 (1979).
  5. Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog. Neurobiol. , (2013).
  6. Dobbing, J., Sands, J. Quantitative growth and development of human brain. Arch. Dis. Child. 48 (10), 757-767 (1973).
  7. Tucker, A. M., Aquilina, K., Chakkarapani, E., Hobbs, C. E., Thoresen, M. Development of amplitude-integrated electroencephalography and interburst interval in the rat. Pediatr. Res. 65 (1), 62-66 (2009).
  8. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with. Dev. Neurosci. 33 (3-4), 251-260 (2011).
  9. Back, S. A., Riddle, A., McClure, M. M. Maturation-dependent vulnerability of perinatal white matter in premature birth. Stroke. 38, 724-730 (2007).
  10. Back, S. A., et al. Late oligodendrocyte progenitors coincide with the developmental window of vulnerability for human perinatal white matter injury. J. Neurosci. 21 (4), 1302-1312 (2001).
  11. Downes, N., Mullins, P. The development of myelin in the brain of the juvenile rat. Toxicol. Pathol. 42 (5), 913-922 (2014).
  12. Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front. Neuroanat. 3 (5), (2009).
  13. Fox, W. M. Reflex-ontogeny and behavioural development of the mouse. Anim. Behav. 13 (2), 234-241 (1965).
  14. Lubics, A., et al. Neurological reflexes and early motor behavior in rats subjected to neonatal hypoxic-ischemic injury. Behav. Brain Res. 157 (1), 157-165 (2005).
  15. Futagi, Y., Toribe, Y., Suzuki, Y. The grasp reflex and moro reflex in infants: hierarchy of primitive reflex responses. Int. J. Pediatr. , 191562 (2012).
  16. Hashimoto, R., Tanaka, Y. Contribution of the supplementary motor area and anterior cingulate gyrus to pathological grasping phenomena. Eur. Neurol. 40 (3), 151-158 (1998).
  17. Isaza Jaramillo, S. P., et al. Accuracy of the Babinski sign in the identification of pyramidal tract dysfunction. J. Neurol. Sci. 343 (1-2), 66-68 (2014).
  18. Donatelle, J. M. Growth of the corticospinal tract and the development of placing reactions in the postnatal rat. J. Comp. Neurol. 175 (2), 207-231 (1977).
  19. Palanza, P., Parmigiani, S., vom Saal, F. S. Effects of Prenatal Exposure to Low Doses of Diethylstilbestrol, o,p’DDT and Methoxychlor on Postnatal Growth and Neurobehavioral Development in Male and Female Mice. Horm. Behav. 40 (2), 252-265 (2001).
  20. Pantaleoni, G. C., et al. Effects of maternal exposure to polychlorobiphenyls (PCBs) on F1 generation behavior in the rat. Fundam. Appl. Toxicol. 11 (3), 440-449 (1988).
  21. Yeomans, J. S., Frankland, P. W. The acoustic startle reflex: neurons and connections. Brain Res. Rev. 21 (3), 301-314 (1995).
  22. Vinay, L., Brocard, F., Clarac, F. Differential maturation of motoneurons innervating ankle flexor and extensor muscles in the neonatal rat. Eur. J. Neurosci. 12 (12), 4562-4566 (2000).
  23. Geisler, H. C., Westerga, J., Gramsbergen, A. Development of posture in the rat. Acta Neurobiol. Exp.(Wars. 53 (4), 517-523 (1993).
  24. Heinen, K., et al. Gabaa receptor maturation in relation to eye opening in the rat visual cortex). 神経科学. 124 (1), 161-171 (2004).
  25. Whishaw, I. Q., Gorny, B., Foroud, A., Kleim, J. A. Long-Evans and Sprague-Dawley rats have similar skilled reaching success and limb representations in motor cortex but different movements: some cautionary insights into the selection of rat strains for neurobiological motor research. Behav. Brain Res. 145 (1-2), 221-232 (2003).
  26. Prusky, G. T., Harker, K. T., Douglas, R. M., Whishaw, I. Q. Variation in visual acuity within pigmented, and between pigmented and albino rat strains. Behav. Brain Res. 136 (2), 339-348 (2002).
  27. Wu, L., et al. Dietary approach to attenuate oxidative stress, hypertension, and inflammation in the cardiovascular system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (18), 7094-7099 (2004).
  28. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and. J. Vis. Exp. (67), (2012).
  29. Rousset, C. I., et al. Maternal exposure to lipopolysaccharide leads to transient motor dysfunction in neonatal rats. Dev. Neurosci. 35 (2-3), 172-181 (2013).
  30. Nguyen, A. T., Bahry, A. M. A., Shen, K. Q., Armstrong, E. A., Yager, J. Y. Consumption of broccoli sprouts during late gestation and lactation confers protection against developmental delay induced by maternal inflammation. Behav. Brain Res. 307, 239-249 (2016).
  31. Black, A. M., Armstrong, E. A., Scott, O., Juurlink, B. J., Yager, J. Y. Broccoli sprout supplementation during pregnancy prevents brain injury in the newborn rat following placental insufficiency. Behav. Brain Res. 291, 289-298 (2015).
  32. Wainwright, P. E. Issues of design and analysis relating to the use of multiparous species in developmental nutritional studies. J. Nutr. 128 (3), 661-663 (1998).
  33. Lazic, S. E., Essioux, L. Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models. BMC Neurosci. 14, 14-37 (2013).
  34. Sergio, D. P., Sanchez, S., Ruben, V. R., Ana, B. R., Barriga, C. Changes in behaviour and in the circadian rhythms of melatonin and corticosterone in rats subjected to a forced-swimming test. J Appl Biomed. 1 (47), (2005).
  35. Castelhano-Carlos, M., Baumans, V. The impact of light, noise, cage cleaning and in-house transport on welfare and stress of laboratory rats. Lab. Anim. 43 (4), 311-327 (2009).
  36. Zimmerberg, B., Ballard, G. A., Riley, E. P. The development of thermoregulation after prenatal exposure to alcohol in rats. Psychopharmacology (Berl. 91 (4), 479-484 (1987).
  37. Fan, L. W., et al. Hypoxia-ischemia induced neurological dysfunction and brain injury in the neonatal rat). Behav. Brain Res. 165 (1), 80-90 (2005).
  38. Smart, J. L., Dobbing, J. Vulnerability of developing brain. VI. Relative effects of foetal and early postnatal undernutrition on reflex ontogeny and development of behaviour in the rat. Brain Res. 33 (2), 303-314 (1971).
  39. Fox, M. W. Neuro-Behavioral ontogeny: A synthesis of ethological and neurophysiological concepts. Brain Res. 2 (1), 3-20 (1966).
  40. Piper, M. C., Mazer, B., Silver, K. M., Ramsay, M. Resolution of neurological symptoms in high-risk infants during the first two years of life. Dev. Med. Child Neurol. 30 (1), 26-35 (1988).
  41. Shiotsuki, H., et al. A rotarod test for evaluation of motor skill learning. J. Neurosci. Methods. 189 (2), 180-185 (2010).
  42. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nat. Protoc. 1 (2), 848-858 (2006).
  43. Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nat. Protoc. 2 (2), 322-328 (2007).

Play Video

記事を引用
Nguyen, A. T., Armstrong, E. A., Yager, J. Y. Neurodevelopmental Reflex Testing in Neonatal Rat Pups. J. Vis. Exp. (122), e55261, doi:10.3791/55261 (2017).

View Video