Este estudo apresenta um método padronizado e validado para o isolamento e cultura de rato primária do estroma do endométrio e pelas células epiteliais, o que pode ser utilizado num sistema de co-cultura para estudo em decidualização vitro.
Decidualization é um processo de diferenciação dependentes de progesterona de células estromais endometriais e é um pré-requisito para a implantação do embrião bem sucedido. Apesar de muitos esforços têm sido feitos para desvendar os mecanismos subjacentes a decidualização, a sinalização exacta entre as células epiteliais que estão em contacto com o embrião e as células do estroma subjacente permanece pouco compreendido. Portanto, estudar decidualization de uma forma que leva tanto a células epiteliais e do estroma em consideração poderia melhorar nosso conhecimento sobre os detalhes moleculares da decidualization. Para este efeito, em modelos in vivo de decidualização artificial são fisiologicamente mais relevante; No entanto, a manipulação de comunicação intercelular é limitada. Actualmente, em culturas in vitro de células do estroma do endométrio, estão a ser utilizados para investigar a modulação de decidualização por várias moléculas de sinalização. Convencionalmente, as células estromais humanas ou mouse endometriais sãousava. No entanto, a disponibilidade de amostras humanas é muitas vezes limitada. Além disso, a utilização de tecidos de murídeo é acompanhada com a variedade no método de cultivo. Este estudo apresenta um método validado e padronizado para obter pura celular endometrial epitelial (CEE) e as culturas do estroma celular (ESC) usando ratos intactos adultos tratados com estrógeno durante três dias consecutivos. O protocolo foi optimizado para melhorar o rendimento, viabilidade, e a pureza das células e foi ainda alargada, a fim de estudar decidualização numa co-cultura de CEE e ESC. Este modelo pode ser adequado para explorar a importância de ambos os tipos de células em decidualização e para avaliar a contribuição das moléculas de sinalização segregadas por significativas CEE ou ESC durante a comunicação intercelular.
O endométrio humano é o revestimento interno do útero e passa por ciclos mensais de discriminação e de reparação como uma preparação para possíveis gravidezes. É constituída por uma única camada de células epiteliais que revestem o lúmen uterino e o estroma subjacente, que varia em espessura de acordo com flutuações de hormonas do ovário de estrogénio e progesterona. Durante a fase lútea, pós-ovulatória do aumento de progesterona irá induzir a diferenciação de células estromais do endométrio em células deciduais maiores, redondos, um processo chamado decidualização 1, 2. Em humanos, este fenómeno ocorre espontaneamente para formar a predecidua, mas torna-se mais pronunciada sobre a implantação do embrião. Uma consequência funcional da decidualização é que o útero se torna transitoriamente receptivo à implantação do embrião. Esse intervalo é rotulado como a "janela de implantação". Durante o período inicial de implantação do embrião, o decidualizado eAs células do estroma que rodeiam o embrião ndometrial implantação irá proporcionar uma barreira para impedir a passagem de substâncias nocivas para o embrião 3. Durante a gravidez, este decídua irá fornecer nutrientes para o feto em desenvolvimento antes placentation teve lugar, e mais tarde irá formar a parte materna da placenta 4.
considerações éticas e práticas limitar a concepção de estudos humanos para investigar o processo de decidualization e levaram o uso de modelos animais. Ser um membro do grupo placentation hemocorial, o endométrio de roedores também irá sofrer decidualization antes placentation 5. Em roedores, no entanto, a iniciação do processo de decidualização depende da presença de blastocistos no lúmen uterino, que indica que um estímulo extra é necessário para desencadear as respostas deciduais 6. Isto implica uma comunicação complexa entre the células endometriais epiteliais que têm contato direto com o blastocisto, e as células do estroma subjacentes. No entanto, decidualization pode ser induzido artificialmente utilizando estímulos como coçar mecânica ou a instilação de petróleo em um útero hormonalmente preparada. Embora os estudos in vivo utilizando modelos decidualization artificiais nos permitiram melhorar os nossos conhecimentos no complexo processo de sinalização de decidualization, mecanicistas estudos aprofundados, por exemplo, a investigação da comunicação indispensável entre células epiteliais e estromais, são limitados. Por isso, os estudos in vitro decidualização pode ser usado para manipular vias importantes e estudar processos fundamentais. Para este fim, as culturas de células do estroma endometrial primárias pode ser configurado a partir de endométrio humano ou roedor. Empregando roedores consente a utilização de animais geneticamente modificados para investigar o papel de uma proteína específica de interesse durante o processo de decidualização. No entanto, imaturo, prepuberTy ratinhos são muitas vezes utilizados de modo a evitar complicações do ciclo estral, enquanto que em outros casos úteros são recolhidos a partir de todas as fases do ciclo estral, o que resulta em uma heterogeneidade nas culturas. Além disso, o processo de decidualização tem sido estudado em diferentes protocolos, por exemplo, por (i) hormonas completar (estrogénio, progesterona ou monofosfato de adenosina cíclico (cAMP)) para o meio de cultura, ou por (ii) isolamento de células deciduais de ratinhos em dia 4.5 de (pseudo) gravidez, o que demanda necessidade adicional de verificação de plug and machos vasectomizados. Estas limitações demonstram a necessidade de um método normalizado para estudar em decidualização vitro. Neste estudo, um modelo fisiológico para examinar decidualization in vitro a partir de adulto, será apresentado (pseudo) ratas grávidas não. Neste método, a injecção diária de 17β-estradiol (E2) vai induzir a proliferação de células do endométrio, resultando num aumento do rendimento de homogéneo e ppopulações de células ure. Além disso, a utilização de um sistema de coculturing permite o estudo da diafonia epitélio-estromal e a capacidade de manipular o processo de decidualização em diferentes níveis.
Decidualization é a diferenciação dependentes de progesterona de células estromais endometriais em células deciduais rodada secretoras. No ser humano, este processo ocorre espontaneamente durante a fase lútea do ciclo menstrual e é iniciada nas células do estroma que rodeiam as células vasculares para formar o predecidua. No entanto, em roedores, a presença de um blastocisto é imperativo para induzir decidualização. O facto de decidualização ocorre apenas após o contacto com as células epiteliais do endométrio implica que os factores importantes são segregadas pelas células epiteliais para induzir decidualização no estroma subjacente. Embora esta diferença na iniciação do processo decidualização deve ser reconhecido, o facto de decidualização humano torna-se mais robusta sobre a implantação do embrião sugere que mecanismos semelhantes poderiam estar envolvidos. Culturas celulares in vitro são muitas vezes utilizados para estudar o efeito de moléculas específicas durante o processo de decidualização.No entanto, a disponibilidade e quantidade de tecido humano que pode ser coletado é muitas vezes limitado e acompanhados por variações, por exemplo, a fase do ciclo, número de gestações e presença de doenças ginecológicas como a endometriose ou adenomiose. Muitos destes problemas podem ser evitados pelo uso de tecido murino, que é facilmente acessível e fase do ciclo independente. Outra grande vantagem do uso de tecido murino, é a possibilidade de utilizar roedores geneticamente modificadas e a possibilidade de instalação de um grande número de experiências. No momento, muitos protocolos de isolamento diferentes foram descritos na literatura com elevada variabilidade na idade dos animais e o período na fase do estro no momento da utilização.
Este estudo apresenta um novo método para a co-culturas primárias de endométrio do estroma e as células epiteliais em que tirou-se vantagem de um ciclo estral padronizado por uma injecção diária de estrogénio antes do isolamento. Além disso, o estrogénio é kNown de induzir proliferação em células epiteliais e do estroma, o que aumenta ainda mais o rendimento por isolamento. O protocolo de isolamento descrito neste trabalho foi baseado em Grant et al. 7, no entanto, foram incluídos outros passos de optimização para aumentar o rendimento, pureza e viabilidade das culturas de células diferentes. Em primeiro lugar, foi sempre HBSS suplementado com antibióticos para evitar a contaminação da cultura primária. Durante o isolamento de MEEC, uma adaptação de temperatura foi feita (15 min a 37 ° C) para aumentar a colheita das células epiteliais durante a primeira digestão. Em seguida, uma etapa adicional foi incluído para temperar a actividade enzimática após tratamento com tripsina-digestão através da adição de meio contendo FBS para inibir a sua actividade. Além disso, MEECs foram passados através de um filtro de malha que foi maior do que aquilo que é vulgarmente descrito (100 pm) como vêm frequentemente em aglomerados e folhas de células. Além disso, a contaminação por células do estroma foi reduzida através da realização de um suplementoitional passo em que MEECs MESCs e foram separadas com base na sedimentação por gravidade. Finalmente, MEECs foram semeadas em lamelas revestidas com colagénio para aumentar a fixação das células para lamelas de vidro, uma vez que se tornou claro que a fixação lamelas de vidro não revestidas ou revestidas com PLL foi insuficiente. Durante o isolamento dos MESCs, colagenase (1 mg / mL) foi suplementado para melhorar a digestão. Além disso, esta etapa de digestão foi realizada em duplicado para evitar a contaminação dos restantes MEECs. Todos estes passos adicionais resultaram em culturas puras e viáveis de populações de células homogéneas.
A pureza da população celular foi avaliada com e imunocoloração de qRT-PCR utilizando vimentina como marcador citoqueratina estromal e epitelial como um marcador. Claramente, foi observado um padrão de expressão oposto da vimentina e citoqueratina em MEEC e MESC. No entanto, pode-se notar que a expressão de ARNm relativa de vimentina e citoqueratina é semelhante nas culturas MEEC. similresultados Ar são publicados por outros grupos de pesquisa, em que as células epiteliais na cultura adquirem expressão de vimentina 9. Mais importante é a diferença na expressão da proteína entre vimentina e citoqueratina como foi observado nas colorações imuno-histológicos das diferentes populações de células. imunomarcação dupla mostrou que EECS foram positivas para citoqueratina e ESC foram positivas para vimentina. A utilização destes marcadores na imunomarcação é um método estabelecido e standardly usado para indicar os tipos de células 10.
Embora uma grande quantidade de investigação tem sido efectuada no decidualização de MESC, continua a ser possível que a presença de células epiteliais neste modelo possam alterar os resultados do decidualização. Em primeiro lugar, foi demonstrado que se MEEC crescer a uma monocamada na presença de meio condicionado por MESC ou numa configuração de co-cultura, a monocamada tem uma melhor resistência transepitelial célula epitelial eléctrica (TEER), resultante de fatores secretados pelo MESC 7. Além disso, Pierro et ai. 11 forneceram provas de que a proliferação epitelial, influenciado por 17β-estradiol, pode ser mediada por factores segregados a partir das células do estroma, e em alternativa, as células epiteliais podem libertar factores que modulam estromal decidualização 12, 13. Em geral, é evidente que o meio de co-cultura do epitélio-estromal proporciona uma situação mais fisiológica que permite a interacção e comunicação parácrina. O método de cultura de dois tipos de células diferentes, utilizando um sistema de co-cultura foi descrita anteriormente inserção 14, 15 e foi adaptado para a utilização de células primárias de murídeo. Pela detecção dos níveis de mRNA da prolactina como um read-out para decidualização, a técnica descrita tem uma muito reprodutível read-out para decidualização disponíveis e permitemé, assim, o estudo da relação epitélio-estromal durante decidualização. sinais parácrinos mediados de MEEC pode alterar a extensão da decidualization nas células estromais. Além disso, o modelo permite a modulação específica do lado epitelial, sem afectar directamente as células do estroma. Por conseguinte, esta co-cultura de MEEC e MESC oferece uma ferramenta perfeita para avaliar o efeito de hormonas, citocinas, etc., em células epiteliais com uma leitura em decidualização do estroma. Outra vantagem deste sistema de co-cultura é que ele permite que os investigadores para investigar o envolvimento de uma proteína específica no processo decidualização quer no compartimento epitelial e estromal, utilizando células isoladas a partir de animais transgénicos. Além disso, esta técnica vai ser muito útil para investigar blastocisto adesão para avaliar se os factores parácrinos secretados por células epiteliais, na presença de um blastocisto são suficientes para induzir a decidualização do estroma subjacentecélulas. Um passo importante na invasão de trofoblastos correlacionada com a degradação da matriz extracelular, que é mediada pela acção de enzimas proteolíticas. A técnica proposta pode ser aplicada como um modelo in vitro para investigar a conversa cruzada entre o blastocisto, as células epiteliais e do estroma de suporte.
No entanto, no momento em que pouco é conhecido sobre a origem das células epiteliais que podem ser bem luminal como glandular. Portanto, é necessária caracterização adicional do perfil de genética e molecular das células epiteliais. Além disso, o método descrito é limitado no conhecimento disponível sobre a polarização das células epiteliais. No momento, a polarização de células epiteliais não foi tomada em conta. No entanto, as diferenças na expressão de proteínas de membrana são descritas nas membranas apicais e basais. polarização inadequado da camada epitelial poderia ter um impacto sobre a interação parácrina entre epitheliai e células estromais. No entanto, os métodos para a obtenção de células epiteliais polarizadas foram descritos e podem ser incluídos na técnica descrita 15, 16.
No total, o protocolo descrito propõe uma técnica para estabelecer com sucesso culturas de células primárias de rato epiteliais do endométrio e células estromais. Esta técnica resulta em culturas de células puras, como confirmado por qRT-PCR e imunocoloração de vimentina e citoqueratina. Em última análise, uma co-cultura de células epiteliais e do estroma foi introduzida que permite a investigação de sinais parácrinos mediada quer por MEEC e / ou MESC no processo decidualização.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação de Pesquisa-Flanders (FWO G.0856.13N) eo Conselho de Pesquisa da KU Leuven (OT / 13/113). KDC é financiado pelo FWO Bélgica. AH é financiado pelo OT / 13/113. Nós gostaríamos de agradecer ao celular instalação de imagem Núcleo da KU Leuven (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) para o uso do microscópio confocal.
ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 µm pore size; transparant | Greiner Bio-one | 662610 | Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0110_0110_0090_0030/13408/ |
Nunc Cell culture treated 24 well plates | Thermo Scientific | 142475 | http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475 |
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma Aldrich | B7880 | Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en®ion=BE |
Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma Aldrich | M1629 | Prepare a stock solution of 250 µM in ethanol. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en®ion=BE |
Arachis oil | Supermarket | Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used |
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PrestoBlue cell viability reagent | Thermo Scientific | A13261 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1 |
HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175-046 | Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046 |
17-β Estradiol | Sigma Aldrich | E8875 | Prepare a stock solution of 1mg/ml in EtOH before diluting in arachis oil (1:1000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en®ion=BE |
Cell medium filter Stericup, 0.22 µm, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized | Merck Millipore | SCGPU05RE | http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063 |
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Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | Gibco | 10500-056 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064 |
Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018 |
Gentamicin (50mg/ml) | Gibco | 15750-037 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037 |
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Sigma Aldrich | D5921 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en®ion=BE |
MCDB-105 | Sigma Aldrich | M6395 | Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en®ion=BE |
Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I1882 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en®ion=BE |
Coverslips, glass, 18 mm Ø | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 1001/18 | http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937&tx_rmproducts_pi1[p]=3504&tx_rmproducts_pi1[v]=20088&cHash=abd12065683fe74b00eaa5e562824d06 |
Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en®ion=BE |
Collagenase type IA from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C2674 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en®ion=BE |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-094 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094 |
Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | T7409 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en®ion=BE |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054 |
Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | BD Falcon | 352340 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680 |
Cell strainer, 100 µm mesh, disposable | BD Falcon | 352360 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680 |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1 |
Acetic acid (glacial) 100% | Merck Millipore | 1.00063 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063 |
Collagen I | Corning | 354236 | From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=&productid=354236%28Lifesciences%29# |
Pancreatin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | P3292 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en®ion=BE |
35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | BD Falcon | 353001 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630 |
Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent | VWR Chemicals | 20821296 | https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP |
monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3) | Cell Signalling Tech | #5741 | use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 |
monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin | Sigma Aldrich | C2562 | use 1/1000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en®ion=BE |
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix | 19943 | http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1 |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en®ion=BE&gclid=Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIwBEiQAI8rq879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k8P8HAQ |
Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en®ion=BE |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-11034 | http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488&resultPage=1&resultsPerPage=15&autocomplete=&searchMode=keyword&productTypeSelect=antibody&targetTypeSelect=antibody_secondary&species=ltechall&keyword=488#filters=genericsort2:%22Capra%20hircus%22;;generic6:^%22Oryctolagus%20cuniculus%22$;;conjugates:^%22Alexa%20Fluor®%20488%22$;; |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 594 | Thermo Scientific | A-11032 | http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594&resultPage=1&resultsPerPage=15&autocomplete=&priorSearchTerms=&searchMode=keyword&productTypeSelect=antibody&targetTypeSelect=antibody_secondary&species=ltechall&keyword=594#filters=genericsort2:%22Capra%20hircus%22;;generic6:^%22Mus%20musculus%22$;; |
VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html |
DPBS, with calcium and magnesium | Gibco | 14040174 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133 |