본 프로토콜은 사이토 카인과 같은 인자 -1 (CLF-1 사이의 상호 작용에 의해 전달된다 섬모 향 신경성 인자 수용체 α (CNTFRα)의 하향 조절을 입증 할 수있는 방법을 웨스턴 블랏 및 리소좀 효소의 억제와 함께 면역 세포 설명 )와 세포 내 이입 수용체 sorLA.
이종 사이토킨 Cardiotrophin 같은 사이토 카인 : 사이토 카인과 같은 인자 1 (CLC는 : CLF-1)합니다 (glycosylphosphatidylinositol (GPI)에이어서 130 / 백혈병 억제 인자 수용체 β 당단백 모집 삼량 체 복합체를 형성 CNTFRα을 -anchored 대상 gp130을 / 신호에 대한 LIFRβ). CLC 및 CNTFRα 모두 신호하지만 지금까지 CLF-1 만 CLC 분비의 추정 촉진제로 알려져있다위한 필요하다. 그러나, 최근 CLF-1 세 개의 결합 부위 포함 나타났다 : CLC 하나씩; CNTFRα 하나 (즉, 삼량 체 복합체의 어셈블리를 촉진 할 수있다); 및 세포 내 이입 수용체 sorLA 하나. CLF-1뿐 아니라, 삼량 체 (CLC : CLF-1 : CNTFRα) 후자 사이트 CLF-1 CLC의 결합 친 화성이 높은 제공 sorLA에 복잡하고 세포를 가용성 리간드 CLF-1 및 CLC를 sorLA 발현 : CLF-1은 빠르게 흡수하고 내장되어 있습니다. CNTFRα 및 sorLA 공동 발현하는 세포에서 CNTFRα 먼저 CLC 바인딩 : CLF-1은 형성한다멤브레인 – 관련 삼량 착체뿐만 아니라 CLF-1에서의 자유로운 sorLA 결합 부위 sorLA 통해 연결된다. 결과적으로, 자체적으로 엔도 시토 시스에 대한 능력이없는 CNTFRα는 함께 당 겼고되고 CLC의 sorLA – 매개 엔도 사이토 시스에 의해 내재화 : CLF-1.
본 프로토콜)는 sorLA 매개과 CLC 전을 설명하는 데 사용되는 실험 절차에 대해 설명 : 표면 막 CNTFRα 표현의 CLF-1에 의존 하향 조절을; ⅱ) 세포 내 이입과 CNTFRα의 대상으로 리소좀 sorLA이 매개; 및 ⅲ) CLC로 하향 조정 세포 반응 : CNTFRα의 sorLA 매개 하향 조절시 CLF-1-자극.
CLF-1 : 1-3 콜레 스테 릭 액정 및 CLF-1 이종 사이토킨 CLC의 두 서브 유닛을 구성한다. 셀룰러 신호 유도, CLC : CLF-1 제 대상은 CNTFRα 그 차 및 GPI-고정 리셉터는 멤브레인 결합 된 삼량 체 복합체를 형성한다. 콜레 스테 릭 액정 : CLF-1 : CNTFRα 단지 이후 모집 횡단은 야누스 키나제 / 신호 변환기 및 전사 3 (JAK / STAT3) 경로 4 활성제를 통해 신호를 중재 gp130을 / LIFRβ. 세 개의 서브 유닛 중 어느 결핍 마우스는 하나의 디스플레이와 같은 표현형 인한 안면 신경 불충분 유아 5-8의 감소 된 수의 출생 후 24 시간 이내에 사망한다. 인간의 연구 결과는 마찬가지로 세 개의 서브 유닛의 기능 일관성을 강조한다. 따라서, 인간의 돌연변이 (동형 접합체 또는 화합물) CLC의 원인이 장애 : CLF-1 또는 CNTFRα, 소위 감기에 의한 발한 / Crisponi 증후군의 모든 결과, 같은 impai 등의 증상을 특징으로하는 조건빨간색 유아 및 삼키는, 다양한 기형 기능, 온도 스파이크, 그리고 역설적 및 저온 9-11에서 땀 관류.
시험 관내에서, CLC 및 CNTFRα의 조합 및 gp130을 필요 / LIFRβ과의 상호 작용 및 셀 (12) 시그널링을 유도하기에 충분한 양이다. 반면에, CLF-1의 역할은 덜 명확하다. 직접적 시그널링에 관련되지 않고, 긴 주로 CLC 1의 세포 분비를 촉진하는 역할을 부록으로 간주되어왔다. 그러나, 최근의 연구 결과는 CLF-1 시그널링 및 CLC와 CNTFRα 회전율 모두 연루 추가 등 중요한 기능을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, CLF-1은 3 개의 독립적 인 결합 부위가 포함되어 있다고 표시 : 하나씩의 CLC 결합 공지; CNTFRα에 바인딩 직접 중재 한; 및 세포 내 이입 수용체 sorLA과의 상호 작용에 대한 세 번째 (높은 친 화성) 사이트. CLC 및 CLF-1 둘 것 & #로(160), 상기 CLC보다 상당히 낮은 친화력과 CNTFRα를 대상으로 : CLF-1 복잡한, (그 CNTFRα 결합 사이트를 통해) CLF-1 CLC와 CNTFRα의 통일을 촉진하여 13 신호를 용이하게 생각할 수있다.
sorLA CLF-1과의 상호 작용이 본 발표의 주요 문제는 완전히 다른 역할을한다. SorLA는 Vps10p 도메인 수용체 가족 (14)를 구성하는 다섯 가지 유형 (1) 수용체의 하나입니다. 이것은 다양한 조직이 아니라 뇌 신경 조직 (15) 내의 특정 표현된다. 다른 가족 구성원과 마찬가지로 sorLA는 Vps10p – 결합 도메인 N- 말단 리간드를 수행하지만, 또한,도 저밀도 지단백질 수용체 패밀리 (15)의 부재에 위치한 리간드 – 결합 요소를 포함하는 다른 도메인 유형을 포함한다. 그것의 세포질 꼬리 여러 어댑터 단백질, 예를 들어, 어댑터 단백질-1, -2, 그리고 sorLA와 상호 작용이 효율적으로 endocytos를 전달입니다뿐만 아니라 결합 단백질 16 ~ 18의 세포 내 정렬 및 전송. Vps10p 도메인은 CLF-1 (단, 특히, CLC 생략) (13)를 포함하여 리간드 무관하는 일련의 바인딩 큰 텐 β 블레이드 프로펠러 (19, 20)를 포함한다. CLF-1의 결합 부위가 액세스 후에도 sorLA뿐만 아니라 결합을 의미 CLC 및 CNTFRα 복잡한 형성 무료 CLF-1뿐만 아니라, CLC : CLF-1과 삼량 체 복잡한 CLC : CLF-1 : CNTFRα 13. SorLA은 CLF-1 및 CLC의 신속한 세포 내 이입 전달 : CLF-1이지만 CNTFRα는 GPI 앵커에 의해 막 표면에 고정되는 반면, 이러한 수용성 단백질이다. / 및 CLF-1 : : : CNTFRα이 sorLA 전체 단지를 내면화 할 수 있도록함으로써 CNTFRα의 표면 막 식 (CLF-1 신호 유도 및 CLC에 후속 세포 감수성)을 변경하는 문제는 CLC의 따라서 경우에 구속력을 또는 CNTFRα의 회전율.
본 실험에 기재된보고서는 다음과 같은 질문을 명확히하기 위해 설계되었습니다 :
sorLA은 CLC를 매개 하는가 : 표면 막 CNTFRα의 CLF-1에 의존 하향 조절? 이를 명확히하기 위해, 초기에 21에서 설명한 바와 같이 대사 라벨링 펄스 추적 실험에 의해 (부재와 sorLA의 존재하에) CNTFRα의 회전율을 결정하려고 시도 하였다. 그러나 CNTFRα는 [S (35)] 시스테인의 혼합물을 사용하여 [S (35)] 메티오닌은 방사능의 가난한 통합을 보였다 레이블을 시도합니다. 이것은 모든 확률 수용체의 급격한 상당한 손실을 보상 할 수 없을 것이다 새로운 합성은 매우 낮은 수준을 제안했다. CLC를 통해 상호 때 CNTFRα이 하향 조절되었는지 확인하려면 : CLF-1 sorLA, 그것은 따라서 단순히 이전과 CLC에 노출 된 후 (웨스턴 블로 팅 사용) CNTFRα의 총 세포 풀을 측정하기로 결정했다 : CLF-1 -과 결과를 비교 세포를 형질 전환 또는 형질하지에sorLA.
sorLA은 리소좀에 CNTFRα을 대상으로합니까? 이 질문에, CNTFRα의 현지화에 대답하기 위해 – 그 CLC를 통해 내면화 : sorLA 결합 CLF-1 매개 – 면역 세포를 이용하여 조사하고, CNTFRα 향하는 항체 및 후기 엔도 좀 / 리소좀 마커 리소좀 관련 막 단백질 1 표시 (LAMP-1). 실험은 리소좀 효소의 억제제로 치료뿐만 아니라 처리 된 세포에서 수행 하였다. 아이디어는 CNTFRα이 리소좀에서 분해 된 경우 처리되지 않은 세포가 CNTFRα에 대해 거의 또는 전혀 염색을 보여줄 것입니다 반면, 효소 억제제로 치료 세포, LAMP-1 긍정적 인 소포에 축적 CNTFRα-염색을 제시 것을 물론이다.
CLF-1 자극 : CNTFRα의 하향 조절은 CLC에 대한 세포 반응을 낮출 수 있나요? JAK / STAT3을 사용하여 gp130을 / LIFRβ 이질 통해 CLC, CLF-1을 CNTFRα 신호 이루어지는 삼량 체 복합체좁은 길. 따라서, 전지의 용량은 CLC에 응답하기 : CNTFRα의 하향 조절시 CLF-1 신호는 웨스턴 블롯 검출 및 sorLA의 형질 전환 체의 인산화 STAT3 (pSTAT3) / 총 STAT3 수준의 정량에 의해 탐험했다.
여기에 설명 된 프로토콜 sorLA 매개 CLC을 설명하기 위해 특별히 사용되는 수 CLF-1 의존성 하향 조절 및 CNTFRα 타겟팅 리소좀뿐만 아니라 CLC에 수반 약화 응답 : CLF-1 자극.
그들은 CNTFRα 및 sorLA 단지 사소한 내인성 발현을 명시 gp130을 / LIFRβ, 형질 쉬우 며 면역 세포 적합 대형 전지 본체를 갖고, 상기 HEK293 세포주는이 프로토콜에 적합하다. 그러나 이론적으로 유사한 특성을 가진 셀 라인은 잘 작동합니다.
이 프로토콜은 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫번째 관심사는 레우 / PEP 매체는 24 시간 동안 약 6 시간마다 교체해야하는 230 단계. 그렇게하지 않으면 활성 리소좀 효소 이하 또는 리소좀 단백질의 탐지되지 축적의 원인이 될 수 있습니다. 두번째 중요한 단계 (3.4) CLC 사전 인큐베이션에 세척 우려 : CLF-1. 그것은 메신저입니다으로 중요 어떤 언 바운드 리간드를 제거하고 세포의 시간이 비추 DMEM (빈 매체)에 (계속 자극을 피할 수) 복구 할 수 있도록. CLF-1 (단계 3.5) :이 CLC와 후속 다시 자극하는 동안 pSTAT3의 낮은 배경 수준을 보장합니다.
특히,도 6은 세포 반응 (pSTAT3)이 CNTFRα의 sorLA 매개 된 하향 조절과 평행하게 감소한다는 것을 보여준다. 이는 감소 된 응답이 CNTFRα 풀의 감소 (그리고 따라 예상 할 수있는)에 따른이지만,이 저 CNTFRα 식 단독 감소 세포 반응을 차지하는 것을 증명하지 않는다는 점을 강조해야한다. 따라서, 변경 – 프리 자극 또는 형질의 결과 – 상류 pSTAT3에 신호 전달 경로의 기능 요소 중 어느 하나가 변경된 응답에 기여 할 수 있습니다.
프로토콜의 기본 개념이이 특별히 한정되지 않는다LAR 수용체 시스템. (. 즉, 다른 세포주, 기타 항체, 기타 리간드 등) – 무관 sorLA's 개입 프로토콜을 수정하여 그것뿐만 아니라 다른 수용체의 리간드 – 유도 하향 조절을 결정하기 위해 사용될 수있다. 그러나, 웨스턴 블 롯팅에 의해 수용체 하향 조절의 분석은 주로 예 수용체 느린 회전율 및 자극되지 않은 세포에서의 새로운 합성의 낮은 정도를 나타내고, GPI 고정 – 수용체에 적합한 것을 주목해야한다. 따라서, 새로운 합성의 하이 레벨을 나타내는 수용체의 리간드 – 유도 수용체 하향 조절이 새로운 합성에 의해 보상 될 수있다. 21에 기술 된 바와 같이 이러한 상황에서 풀 수용체의 하향 조절 대신 대사 라벨링 펄스 추적 실험에 의해 결정될 수있다. 선택적으로, 수용체를 방해하지 요오드화 항체 (바람직 된 Fc 단편)의 "태그"를 RECEPT의 ectodomain하는데 사용될 수 바인딩또는, 상기 예상 하향 조절은 세포 펠릿과 배지 방사성 계수에 의해 결정될 수있다.
물류 이유로 우리는 CNTFRα 우리의 세포는 Myc와 태그를 들고 구성 형질, 본 프로토콜에서 마우스 항 – Myc와 항체 수용체의 웨스턴 블롯 검출에 사용되었다. 대조적으로, 염소 항 – CNTFRα 항체 LAMP-1 마우스 항체에 의해 검출되었을 때 면역 세포 및 이중 표지에 사용 된 – 분명 이차 항체 불특정 (중첩) 염색 초래 개의 기본 마우스 항체를 사용한다. 염소 항 – CNTFRα도 (도시 생략) 웨스턴 블 롯팅에서 작동하기 때문에, 프로토콜은 쉽게 수정 및 태그가없는 CNTFRα 형질 세포에 적용 할 수 있습니다.
고친 화도 22 CLF-1 : 마지막으로, 최근에는 세포 내 이입이 수용체 sortilin CLC 결합하는 것으로 나타났다. 따라서, 생각할 수있는 그 sortilin처럼이며sorLA는 CLC에 상호 : CLF-1을 통해 CNTFRα 및 세포 내 이입뿐만 아니라 CNTFRα의 대상으로 리소좀을 중재 할 수 있습니다. 대신 sorLA의 sortilin을 사용하여, 본 프로토콜은이 문제를 명확히하기 위해 사용될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements.
Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | |
FuGENE 6 Transfection Reagent | Roche | 11 815 091 001 | |
4-well plates (Nunclon Delta Surface) | Thermo Scientific | 176740 | |
Safe-Lock tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
Dulbecco Modified Eagle´s Medium | Lonza | BE12-604F/U1 | |
Fetal bovine serum | Thermo Scientific | 10270106 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | |
Dulbecco Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30028.02 | |
CLC:CLF-1 | R&D Systems | 1151-CL/CF | |
Mouse anti-LAMP-1 | DSHP | H4A3 | |
Rabbit anti-sorLA | Reference 16 | ||
Mouse anti-b-actin | Sigma | A2228 | |
Mouse anti-Myc | Genscript | A00704 | |
Goat anti-CNTFRa | R&D Systems | AF-303 | |
Rabbit anti-pSTAT3 | Cell signaling Technology | 9145s | |
Mouse anti-STAT3 | Cell signaling Technology | 9139s | |
Anti-mouse HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7076s | |
Anti-rabbit HRP-linked antibody | Cell signaling Technology | 7074s | |
Anti-goat HRP-linked antibody | Dako | P0160 | |
Donkey anti-goat secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen | A11055 | |
Donkey anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | A10037 | |
Leupeptin | Sigma | L8511-5MG | |
Pepstatin A | Sigma | P4265-5MG | |
Triton X-100 | AppliChem | A1388 | |
Tris-HCl | Merck | 1,082,191,000 | |
EDTA:Titriplex III | Merck | 1,084,180,250 | |
cOmplete mini EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
PhosSTOP | Roche | 04 906 837 001 | |
LDS sample Buffer (4X) | Novex | NP0007 | |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
4% paraformaldehyde | VWR | 97,135,000 | |
Saponin | Sigma | S7900-100G | |
Mounting Media | Dako | S3023 |