La combinaison humide et Techniques de laboratoire sec Guide pratique du Cristallisation de grandes superhélice contenant des protéines
概要
We describe a framework incorporating straightforward biochemical and computational analysis to guide the characterization and crystallization of large coiled-coil domains. This framework can be adapted for globular proteins or extended to incorporate a variety of high-throughput techniques.
Abstract
Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are found throughout nature, however, because of their physical properties and tendency to aggregate, they are traditionally viewed as being especially difficult to crystallize. Here, we utilize a variety of quick and simple techniques designed to identify a series of possible domain boundaries for a given coiled-coil protein, and then quickly characterize the behavior of these proteins in solution. With the addition of a strongly fluorescent tag (mRuby2), protein characterization is simple and straightforward. The target protein can be readily visualized under normal lighting and can be quantified with the use of an appropriate imager. The goal is to quickly identify candidates that can be removed from the crystallization pipeline because they are unlikely to succeed, affording more time for the best candidates and fewer funds expended on proteins that do not produce crystals. This process can be iterated to incorporate information gained from initial screening efforts, can be adapted for high-throughput expression and purification procedures, and is augmented by robotic screening for crystallization.
Introduction
Détermination de la structure par cristallographie aux rayons X a apporté des contributions fondamentales à tous les domaines de la biologie moderne; fournissant une vue atomique des macromolécules qui soutiennent la vie et comment ils interagissent les uns avec les autres dans une variété de contextes; ce qui nous permet de comprendre les mécanismes qui causent les possibilités de maladies et de fournir à la conception rationnelle des médicaments pour traiter la maladie. Cristallographie a longtemps été la technique expérimentale dominante pour déterminer la structure macromoléculaire, et représente actuellement 89,3% de la base de données structurelle (www.rcsb.org). Cette technique présente de nombreux avantages, y compris le potentiel de très haute résolution, la possibilité de visualiser des macromolécules avec un large éventail de tailles, la collecte de données relativement facile, et la possibilité de visualiser comment la macromolécule interagit avec le solvant ainsi que des ligands.
Malgré de nombreuses améliorations technologiques dans l' expression de protéines recombinantes 1,2, purification 3, et la biologie moléculaire utilisé pour générer ces systèmes 4, le principal obstacle dans le processus cristallographique reste la capacité à produire des cristaux de qualité de diffraction. Cela a été particulièrement vrai pour les protéines qui contiennent de grands domaines coiled-coil. Il a été estimé que jusqu'à 5% de tous les acides aminés se trouvent dans les bobines enroulées 5,6, ce qui en fait une caractéristique structurelle très commun 7, mais ces protéines sont souvent plus difficiles à purifier et cristalliser que les protéines globulaires 8-10 . Ceci est encore aggravé par le fait que les domaines bispiralés sont souvent trouvées dans le contexte d'une protéine plus grande, par conséquent prédire correctement les limites de ces domaines est essentielle pour éviter l'inclusion d'une séquence non structurée ou flexible qui est souvent préjudiciable pour la cristallisation.
Ici, nous présentons un cadre conceptuel combinant calcul basé sur le Web avec des analyses experimental données sur le banc, pour aider les utilisateurs de guidage à travers les étapes initiales du processus cristallographique, notamment: comment sélectionner fragment (s) de protéines pour des études structurales, et la façon de préparer et de caractériser des échantillons de protéines avant les tentatives de cristallisation. Nous concentrons notre analyse sur deux protéines contenant de grands domaines coiled-coil, Shroom (SHRM) et Rho-kinase (Rock). Ces protéines ont été choisis car ils contiennent tous les deux des domaines bispiralés et sont connues pour former un complexe biologiquement pertinente 11-16. Shroom et Rho-kinase (Rock) sont prévus pour contenir ~ 200 et 680 résidus de superhélice respectivement, de nombreuses portions qui ont été caractérisés structurellement 17-20. La méthode décrite ici fournit un flux de travail simplifié pour identifier rapidement des fragments de superhélice contenant des protéines qui se prêter à la cristallisation, cependant, les techniques décrites peuvent être facilement adaptés pour la plupart des protéines ou complexes protéiques ou modifiés pour incorporer à haut débit approChes comme disponible. Enfin, ces méthodes sont généralement peu coûteux et peuvent être effectuées par les utilisateurs à presque tous les niveaux d'expérience.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici est conçu pour aider l'utilisateur à identifier les limites du domaine au sein de grandes protéines superhélice pour faciliter leur cristallisation. Le protocole repose sur une intégration globale d'une série de données à partir des prédictions de calcul et d'autres sources pour générer une série de limites des domaines potentiels. Ils sont suivis par une série d'expériences biochimiques qui sont rapides et peu coûteux, et qui sont utilisés pour affiner ces premi?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant NIH R01 GM097204 (APV and JDH). Funding for JHM was supplied by an HHMI Undergraduate Research Summer Fellowship.
Materials
| BL21(DE3) Rosetta | Emd Millipore | 70954-3 | |
| BL21(DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | |
| BL21(DE3) Codon Plus | Agilent Technologies | 230245 | |
| Lysozyme | Spectrum Chemical Mfg Corp | L3008-5GM | |
| Ni-NTA resin | Life Technologies | 25216 | |
| SubtilisinA | Spectrum Chemical Mfg Corp | S1211-10ML | |
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-160 | |
| INTELLI-PLATE 96: | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
| PEG 3350 | Hampton research | HR2-591 | |
| PEG 8000 | Hampton research | HR2-515 | |
| PEG 400 | Hampton research | HR2-603 | |
| PEG 4000 | Hampton research | HR2-605 | |
| pcDNA3.1-Clover-mRuby2 | Addgene | 49089 | |
| Overnight Express Autoinduction System 1 | Emd Millipore | 71300 | |
| Lysogeny Broth powder | ThermoFisher Scientific | 12795027 |
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