The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.
이 프로토콜은 3 차원 (3D)의 발생 생체 간 모델 및 바이러스 벡터 시스템의 연구 및 개발에의 응용을 설명한다. 이 모델은 인간 간세포 세포주와 decellularized 래트 간 세포 외 기질을 다시 채우기에 의해 얻어진다. 이 모델은 살아있는 동물에 유해한 실험을 대체하는 혈관 3D 전지 시스템 연구를 허용한다. 또 다른 장점은 동물 모델보다 인간 생리에 가까운 모델의 인간화 특성이다.
본 연구는 아데노 – 관련 바이러스 (AAV 벡터) 유래의 바이러스 벡터와이 간 모델의 전달을 입증한다. 미디어와 3D 간 모델을 공급하는 관류 회로는 벡터를 적용 할 수있는 쉬운 방법을 제공합니다. 시스템 간 주요 대사 파라미터의 모니터링을 허용한다. 최종 분석을 위해, 조직 샘플은 recellulariza의 범위를 결정하기 위해 수행 될 수있다조직 학적 기술에 의해 기. 전달 된 유전자의 바이러스 벡터와 표현의 분포를 정량적 PCR (qPCR에), 웨스턴 블롯 및 면역 조직 화학 염색에 의해 분석 될 수있다. 기초 연구 및 유전자 치료 응용 개발 벡터 모델의 다수의 애플리케이션은 신규 한 항 바이러스 치료법의 개발, 암 연구 및 바이러스 벡터에 관한 연구 및 잠재적 부작용을 포함하여 구상 할 수있다.
Most current biomedical research relies on one of two approaches, either two-dimensional (2D) cell culture experiments or animal models, which are three-dimensional (3D) by their very nature. However, these approaches have some severe drawbacks. Cells grown in 2D culture have been shown to differ in gene expression patterns and cell physiology from those cultivated under 3D conditions.1 Animal models, in addition to being associated with ethical concerns, often do not model human physiology well. Although the lack of obvious toxic effects of a compound must be confirmed in animal models prior to the first dosing in humans, multiple cases have been documented in which severe, sometimes fatal, adverse effects have occurred in clinical trials.2
To overcome these shortcomings, humanized 3D ex vivo organ models have become important research tools. When cultivated under suitable conditions, cells self-assemble into 3D structures known as spheroids. However, these spheroids lack a vascular system, which limits the distribution of small molecular compounds, large biologics and viral vectors alike. For example, adenoviral vectors only transduced the outer cell layers of spheroids prepared from human glioblastomas.3 A solution to this problem is the use of an organ model containing a vascular system. To this end, the organ of interest can be explanted from an animal, and the animal cells can be replaced by human cells. Various methods for decellularization of animal livers by treatment with detergents or sodium cholate have been described.4-6 The resulting extracellular matrix (ECM) harbors cytokines and growth factors which regulate various cellular processes.7 It can be used as a scaffold for recellularization with human cells to obtain a functional organ model.
In a recent study, we used a humanized 3D liver model to study distribution and transgene expression of an adeno-associated virus (AAV) vector.8 AAV vectors belong to the most promising viral vectors for gene therapeutic applications.9 The first, and to date only, approved gene therapeutic intervention in the Western world uses an AAV vector for the transfer of lipoprotein lipase.10
여기에 설명 된 재구성 차원 간은 인간화 시스템에서 바이러스 벡터를 연구하는 모델을 제공합니다. 인간의 간세포 암 세포주와 쥐의 간의 ECM의 다시 채우기가 큰 바이오 의약품의 연구를 허용하는 혈관 시스템을 생성합니다. 이러한 결과는 개념 증명 재구성 간 모델을 효율적으로 바이러스 벡터로 형질 도입 될 수있다 제공한다.
여기에 도시 된 실험에서 간 각자 로브는 AAV 벡터에 의해 형질 도입 하였다. 그러나, 몇 가지 예비 실험에서, 단일 엽 세포 증식을하지 않았다. 이 혈관 폐색 시스템에서 세포 파편 또는 다른 구성 요소를 방지하는 것이 중요하다. 모든 돌출부가 관류 될 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 페놀 레드 등의 무독성 염료 간 모델을 플러싱 할 수있다.
또 다른 중요한 문제는 멸균 간 골격을 유지하고있다. 에탄올 또는 항생제 치료는 disadv 동안antageous 혈관 시스템, γ-방사선의 세포 외 기질의 조사가 혈관을 보존 시료를 멸균.
recellularization 절차 및 시간 다시 채우기 위해 사용되는 세포의 수는 재현 가능한 결과를 얻기 위해 조정되어야 할 수 있도록 또한, 이식 된 간 크기가 다르다.
본 연구에 사용 된 쥐 간은 비교적 큰 셀 테스트 시약 (예컨대, AAV 벡터)의 대용량을 필요로한다. 또한, 다시 채우기 절차는 2 주 이상 걸렸다. 이것은 합리적인 노력을 함께 할 수있는 복제의 수를 제한합니다. 현재는보다 적은 세포 적은 테스트 시약의 사용을 허용 쥐 간 부피의 약 오분있는 마우스 간을위한 모델을 설정한다. 세포 수의 비례 미세화는 타당하지만, 정확한 양은 작고에 결정되어야그녀의 실험.
본 모델의 또 다른 단점은 간세포 인 HepG2 세포주를 사용하는 것이다. 실험은 생리 학적 관련성이 모델을 제공 유도 다 능성 줄기 세포로부터 분화 된 간세포의 사용을 개발하는 것이 계속된다. 또한, 간은 간세포, 예를 들면, 쿠퍼 세포 및 sinosoids 외에도 여러 종류의 세포로 구성된다. 우리는 ECM이 여러 세포 유형으로 recellularized 때 다른 세포 유형의 자연 환경을 다시 채워야한다고 가정합니다.
차원 간 모델은 몇 가지 장점을 결합한다. 생체 내 모델에서 기존의 가장 큰 단점은 동물 생리학은 인간의 생리 실질적으로 차이가 있다는 것입니다. 인간 환자의 치료 독성 부작용 때문에 미결 남아있다. 이러한 단점은 더 가깝게 후 생물학 반영 인간 세포 간 차원 모델을 재구성함으로써 극복 될 수있다남자 환자.
간 모델의 두 번째 장점은 동물 복지에 기여한다. 동물 성분이 재구성 실험 요구되지만 잉여 동물 즉 즉, 추가적인 동물은 필요하지 않다, 다른 동물 실험을 위해 희생되었다 사용될 수있는 바와 같이, 방법은 여전히 3R 원칙 (여분 환원, 정제)의 목적을 따른다 접근 방식은 완전히 자주 생체 실험과 연관된 동물의 고통을 피할 수 있습니다. 구 상체는 3D 시스템에서 세포 과정을 연구하기위한 대체 수단이다. 많은 생물학적 물질이 구조의 내측 부분에 깊이 침투하지 않도록하지만, 타원체는 혈관 아니다. 이러한 문제는 혈관 간 3D 모델로 극복되었다.
가 유전자 치료에 가장 유망한 후보 중에서 때문에 여기에 설명 된 실험에서 AAV 벡터는 조사했다응용 프로그램. 수많은 유전자 치료 접근법 간염 바이러스 또는 알파 -1- 항 트립신 결핍증 감염의 치료를 위해, 예를 들면, 간을 표적 겨냥은 3D 간암이 AAV 벡터를 개발하는 과정에서 사용될 수있다. 또한, 물론, 다른 hepatotropic 바이러스 벡터, 예를 들어, 아데노 바이러스 벡터의 조사에 적합하다. 또한, 이러한 간염 B 또는 C 바이러스 감염성 간염 바이러스를 연구하기 위해 사용될 수있다. 또, 예를 들면, 바이러스의 새로운 전략을 설계하는데 이용 될 수있다. 또한, 3D 모델 기관의 암을 치료 및 독성 학적 연구를 수행하기 위해 새로운 세포 증식 치료법을 개발하는 유망한 도구를 나타낸다. 긴 안목에서 인공 간은 이식 등 재생 의학에 이용 될 수있다. 함께, 차원 간 모델은 감염 생물학에 응용 프로그램 및 생물 의학 연구의 다른 분야의 넓은 범위를 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Bernd Krostitz for technical assistance, Radoslaw Kedzierski for initial contributions to the project, Erik Wade for proofreading and giving helpful comments, and Prof. Heike Walles for providing the bioreactor and sharing her valuable experience with organ decellularization. We are also thankful for funding of the project and publication by the Berlin University of Technology.
Incubator | Fraunhofer | / | |
Peristaltic Pump | Fraunhofer | / | |
Flange with groove | Duran | 2439454 | modified by gaffer |
O-Ring Transparent | Duran | 2922551 | |
Quick Release Clamp | Duran | 2907151 | |
Flat Flange Lid | Duran | 2429857 | modified by gaffer |
Screw thread Tube | Duran | 2483802 | modified by gaffer |
Screw thread Tube | Duran | 2483602 | modified by gaffer |
Silicone sealing Ring | Duran | 2862012 | |
Screw Cap | Duran | 2924013 | |
Screw Cap | Duran | 2924008 | |
Screw Cap with aperture | Duran | 2922709 | |
Screw Cap with aperture | Duran | 2922705 | |
Filter | Sarstedt | 831,826,001 | |
Silicone Tubing | VWR | 228-1500 | |
Tube connector | Ismatec | ISM556A | |
Biocompatible Tubing | Ismatec | SC0736 | |
T175 culture flasks | Greiner bio-one | 660 160 | |
RPMI 1640 | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0501-500 | |
glutamine | BioWest SAS (Th. Geyer) | X0551-100 | |
Trypsin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0940-100 | |
penicillin/ streptomycin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0022-100 | |
fetal calf serum | cc pro | S-10-M | |
Tissue-Tek O.C.T. | Weckert-Labortechnik | 600001 | |
HepG2 | DSMZ | ACC 180 | |
Cryomold 15x15x5mm | Sakura | 4566 | |
Biopsy punch 4mm | pfm medical | 48401 | |
Nucleospin miRNA | Macherey & Nagel | 740971.10 | |
Nucleospin RNA/DNA Buffer Set | Macherey & Nagel | 740944 |