Antikor parçalarının bir kütüphanenin taranması için bakteriyel iç zar görüntü

1. ssTorA sinyal sekansının bir füzyon olarak scFv kitaplığı hazırlamak Bir scFv geni varyantlarını ihtiva eden bir deoksiribonükleik asit (DNA) kütüphane elde edin. Not: kütüphanesi de tüm scFv geni veya hedeflenen etki fazla çeşitlilik oluşturmak için uygun olan herhangi bir modu kullanılarak yapılabilir 22 (örneğin, belirleyici bölgeler üçüncü tamamlayıcılık, CDR3s.). Standart moleküler klonlama yöntemleri 23 kullanılarak PIMD plazmid (Şekil 2) DNA kütüphanesinin yerleştirin. Not: Bu plazmid, (scFv N-terminali) ssTorA sinyal sekansına genetik füzyon ve FLAG epitop (scFv C-terminal) ve scFv'leri ifade eder. İç membran görüntü için plazmidin tasarım, daha önce 19 tarif edilmiştir. PIMD plazmid yazarların edinilebilir. <br/> Şekil 2. İç zar görüntüleme plazmid (PIMD) harita (Basamak 1.3 ile 1.2). Bu plazmid, lak promoter, ColE1 replikasyon orijini ve bir kloramfenikol direnç geni de içerir. eklenen scFv geni, aynı okuma çerçevesi içinde tüm üç ile Tat yolu ve bir FLAG epitop etiketine scFv hedef ssTorA sinyal sekansına kaynaştırılır. Kısıtlama enzimi yerleri gösterilmiştir. Xbal ve Notl kısıtlama enzimi siteleri arasına yerleştirilir bir kütüphane, plazmid büyüklüğü 2219 bp artı scFv boyutudur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. MC4100 E. kütüphaneleri ihtiva eden plazma DNA Dönüşümü coli hücreleri 23. Kurtar ve kütüphanenin bu bakteri formunu büyür. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüje hücreleri toplamak için. Süpernatantı ve toplanan hücreleri tekrar süspansiyonLuria-Bertani (LB) medya% 25 gliserol içinde. -80 ° C'de saklayın alikotları gerekli ya da 2. Adıma geçin kadar. NOT: protokol, diğer E. rağmen, MC4100 hücreleri ile doğrulanmıştır E. coli suşları, aynı zamanda protokole uygun olması beklenmektedir. Elektroporasyon, yüksek transformasyon verimi nedeniyle dönüştürme için tercih edilen bir yöntemdir. Kitaplık tipik olarak en az 10, scFv, bu aşamada varyantları 9 arasında olmalıdır, ve her bir sıvı bölüntü bir kütüphane 100 kat örtülecek kadar yeterli hücre içermelidir. 2. spheroplastlar Kütüphane Hızlı ve hazırlayın RT'de (Kademe 1.3) bakteriyel kütüphanesinin bir kısım Çözülme ve 20 ug / ml kloramfenikol (cm) 100 ml LB ortamı ihtiva eden bir şişeye kısım ekleyin. 37 ° C'de 3 saat ve kuluçkaya çalkalayıcı 225 rpm için büyür. 3 saat sonra, 37 ° C enkübe çalkalayıcı balonun çıkarın. için scFv kitaplığı ekspresyonunu VerenBir inkübe çalkalayıcıda 15 rpm, 20 ° C de saat 22 ve 225 için O / N devam edin. NOT: Hiçbir indükleyici gerekli organizatörü sızdıran olduğu gibi PIMD plazmid kullanırken. MC4100 hücreleri Lac bastırıcı aşın yok (ve Laci plazmid üzerinde bulunmayan) unutmayın. Şekil 3. E.coli hücreleri ve sferoplastlar. (A) E. coli hücreleri silindir şeklindedir. (B) EDTA ve lizozim, E. dış membran kullanılarak spheroplasting sonra E. coli, hücreler yırtılmakta ve elde edilen sferoplastlar şekli küreseldir. Diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi görüntüleri. Ters bir mikroskop bir 100X objektif kullanılarak elde edilmiştir Lütfen cBu rakamın büyük halini görmek için buraya yalamak. kütüphane spheroplastlar hazırlayın. NOT: spheroplastlar E. dış zarını oluşturulmaktadır E. coli (Şekil 3), şekil bakımından küreseldir. Gerekli tamponlar hazırlayın. Not: Tüm tamponlar steril olmalıdır. Damıtılmış H 1000 ml'lik bir son hacme kadar 2 O 2 PO 4 HPO 4 8 g NaCl, 0.2 g KCI, 1.44 g 2 Na çözülmesiyle (pH 7.4 PBS) ve 0.24 g KH 1 x fosfat tamponlu tuzlu su hazırlayın. buz üzerinde tutun. % 0.1 PBS Hazırlama 200 mi 1 x PBS içinde 0.2 g BSA çözülmesiyle sığır albümin serumu (BSA) (ağ / hac). buz üzerinde tutun. Steril filtre edildi, 1 M sukroz, 1 M Tris tamponu (pH 8.0) ve 1.5 ml 1 ml damıtık H2O 7.5 ml karıştırılarak fraksiyonasyon tamponu (FB) hazırlanması buz üzerinde tutun. 30 ul o eklenerek 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) hazırlanmasıH2O damıtılmış f 0.5 M EDTA ile 14.97 mi 100 ml 4.76 g MgCI2 çözülmesiyle, 0.5 M MgCl2 Hazırlama H2O damıtılmış buz üzerinde tutun. çalkalayıcı balonun çıkarın ve hücre yoğunluğu belirlemek için bir spektrofotometre kullanılarak 600 nm'de optik yoğunluk (OD) ölçün. Kaynaklı kültür hacmi spheroplasting her numune, 1 x 10 10 hücreleri olduğu, gerektiğinde hesaplayın. Not: E. 10 9 hücre / ml'lik bir konsantrasyon gösteren bir OD 1 600 yaklaştırılması E. coli 24 kullanılabilir. Santrifüj 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 12,000 x g'de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde indüklenen kültür hesaplanan hacmi. Sorun numune hazırlama ortaya çıkan halinde, en az iki numune hazırlayın. santrifüjlenmiş kültürlerden Süpernatantı ve buz soğukluğunda FB 100 ul her bir hücre pelletini. 12.000 × santrifüj1 dakika için oda sıcaklığında G ve daha sonra pipet ile süpernatantı. / Ml lizozim, 10 mg 3.5 ul desteklenmiş buz soğukluğunda FB 350 ul her bir pelletini. , Damla damla ilave 1 mM EDTA, 700 ul yavaşça her tüp vorteks ve yavaş yavaş örnekleri karıştırmak için bir boru rotator dönerken, daha sonra 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. , Rotator tüpleri çıkarın her tüpe buz soğukluğunda 0.5 M MgCl2, 50 ul ve 10 dakika süreyle buz üzerinde inkübe. Santrifüj 10 dakika boyunca 4 ° C'de 11,000 x g'de borular. sferoplast pelet izole edin. yavaş yavaş pelet kısmını çekmek için 1 ml ucu ile bir mikropipet kullanın. doğrudan yeni bir 1.5 ml'lik tübe Yukarıdaki açıklığı olan bir açıyla boru tutarken, yavaşça yüzer üzerinden pipet kaldırın ve yeni bir tüp içine pelet kaydırın. süpernatan önemli bir hacim yeni bir tüpe aktarılır ise, pipetleme çıkarın. pelet firması eno değilseöf yine 2 dakika ve girişimi pelet izolasyonu için 11.000 x g'de yeniden santrifüj, transfer. buz soğukluğunda 1 x 1 ml PBS, her bir tüp içinde sferoplast pelletini. pipetle ve topak tamamen yeniden süspansiyona kadar yavaşça girdap tutucuya girdap arasında gidip. Bir seferde en fazla 2 dakika süreyle buz kapalı örnekleri tutmak ve tekrar buz çıkarmadan önce en az 5 dakika boyunca buz iade etmeyin. Aşama 4'te kaydırma için kullanılana kadar (en fazla 2 gün), 4 ° C'de spheroplastlar tutun. 3. Manyetik boncuklar üzerine hedef antijen hareketsiz E. Rekombinant üretim sırasında, in vivo olarak, hedef antijen Biotinylate coli hücreleri. Alternatif olarak, kimyasal konjugasyon 25 ya da zaten biyotinile edilmiş satın alma hedef antijeni kullanın ve 3.2 adıma geçin. 10 x bisin tampon yapmak için 50 mi su 816 gr bisin ekleyin. buf seyreltin50 ° C'ye kadar damıtılmış H2O ve ısı fer 1 x. 10 mM bisin tamponunda 5 mM biyotin bir biyotin çözelti yapmak için ısıtıldı 1 x bisin tampon 12 ml 14.7 mg biyotin ekleyin. kadar gerekli -20 ° C'de saklayın. Hızlı ve biyotin karboksil taşıyıcı protein (BCCP) bir füzyon olarak hedef antijenin üretimine olanak sağlar pAK400cb-BCCP plazmid 26 kullanılarak hedef protein biotinylate. NOT: E. coli hücreleri doğal olarak biotinylate BCCP, arındırmak ve kimyasal olarak önceden streptavidin kaplı boncuklar immobilizasyon hedef protein biotinylate ihtiyacını ortadan kaldırır. Yerli E. E. coli biyotin ligaz BirA füzyon proteinini biyotinile için yeterlidir. E. büyütün E. coli O (BCCP N-terminaline füzyon olarak yerleştirilmiş hedef antijen ile birlikte) biyotinilasyon plasmid ihtiva eden / N çalkalanırken 37 ° C'de mi Cm 20 ug / ile takviye edilmiş LB ortamı 15 saat 18 5 mi 225 rpm. 20 ug / ml Cm denklemi kullanılarak 0.05 25 mi taze LB ortamı, bir başlangıç OD alt kültür kültür gerekli (V eklenti) hacminin bir spektrofotometre kullanılarak 600 nm'de OD ölçme ve hesaplama: H ekleme = (0.05 × 25 ml) / (OD 600 – OD 600 O / N kültür ve V eklenti optik yoğunluk 0.05), taze LB eklemek için O / N kültürünün hacmi Alt kültür ve 37 ° C ve 225 rpm'de inkübe çalkalayıcıda 0.8, 0.5 OD'ye büyür. izopropil p-D-1-tiogalaktopiranosid 5 uM bir nihai konsantrasyona kadar bir son 100 uM konsantrasyona ve biotin ekleyin. 20 ° C ve 225 rpm'de 15 saat 22 için bir çalkalayıcı içinde inkübe ifadesini teşvik eder. 10 dakika boyunca 4 ° C'de 4000 x g santrifüjleme ile hasat bakteri. süpernatantı. Kullanım için hazır olana kadar -20 ° C 'de pelet saklayın. EklemekHücre peleti, 0.2 g başına bir hücre parçalama deterjan 1 mi. pipetle yeniden süspanse edin ve yavaşça hücreleri lize etmek için 20 dakika boyunca döner. liziz sonra 16,000 x g'de santrifüj ile 20 dakika boyunca 4 ° C. yeni bir 1.5 ml'lik tüp içine Çözünür lizat (süpernatant) Pipet. Bağlanmamış biyotin çıkarmak için 3 kDa'lık bir moleküler ağırlık cutoff sütunu kullanın. üreticinin talimatlarına uygun olarak 20 ° C'de sütun içine lizat ve santrifüj Pipet. lizat biotin 100 kat seyreltildikten ve yıkandı lizat hacmi lizatının orijinal hacmine eşit olana kadar 1 x PBS ile yıkayın. Yeni bir tüp lizat aktarın. Streptavidin kaplı manyetik boncuklar üzerine biyotinile edilmiş hedef antijeni hareketsiz. Aşama 2.3.1 tarif edildiği gibi 1 x PBS ve BSA (w / v)% 0.1 1 x PBS hazırlayın. manyetik boncuk hazırlayın. Not: Bu, bir manyetik ayırma raf kullanılmasını gerektirir. süspanse streptavorijinal şişede manyetik boncuklar pipehdin kaplı. ya da en azından 30 saniye için ya vorteks 5 dakika boyunca döner. 1.5 ml tüp 7-10 × 10 9 boncuk aktarın. NOT: İstenilen ses üreticisi tarafından sağlanan boncuk konsantrasyonuna bağlı olacaktır. tüp tarafında boncuk toplamak için 2 dakika süreyle manyetik raf boncuklar içeren tüp yerleştirin. mıknatıs hala tüp dikkatlice boncuk bozmadan pipetleme süpernatant kaldırmak. yıkamak, mıknatıstan tüp kaldırmak ve kabarcıklar oluşturmadan pipetleme 1 × 1 ml PBS boncuklar tekrar süspansiyon. boncuk toplamak için 2 dakika süreyle mıknatıs tüp dönün ve dikkatli pipetleme süpernatant kaldırmak. üç yıkamadan toplam işlem iki kez daha tekrarlayın. Hiçbir sıvı nihai yıkamadan sonra tüp kalan olduğundan emin olun. Manyetik BEA biyotinile antijeni içeren lizat eklemeds. Mıknatıs tüp çıkarın ve (Kademe 3.1.5 arasında) lizat, 1 ml içinde yeniden süspanse boncuklar. hafifçe dönerken, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 3 dakika antijen kaplı boncuk toplamak için mıknatıs tüp yerleştirin. Adımlar 3.2.2.4 için 3.2.2.3 tarif edildiği gibi aynı şekilde,% 0.1 BSA ile 1 x PBS ile kaplı boncuklar beş kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, Aşama 3.2.2.2 kullanılan aynı hacme% 0.1 BSA ile 1 x PBS içinde yeniden süspanse boncuklar. Hareketsizleşmiş hedef antijen 4 ° C 'de stabil ise kaydırma için gerekli olana kadar, 4 ° C de, kaplanmış boncuklar saklayın. Aksi takdirde, 4. Adıma geçin. 4. Ekran Hedef Antigen karşı gezdirme ile scFv Kütüphanesi (Şekil 4) Şekil 4. Kaydırma (Aşama 4). Antijen-kaplı manyetik boncuklar arE antikor kitaplığı varyantlarını eksprese spheroplastlar inkübe edildi. Boncuk bağlı spheroplastlar plazmid DNA geri kazanılmış ve ELISA bazlı bir ekran kullanılarak taranır bir alt kütüphanesi oluşturmak için kullanılır. Protokol adımlar belirtilmiştir tekabül etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. spheroplastlar ile kaplanmış boncuklar inkübe edin. Yaklaşık 5 oranını boncuk için bir sferoplast kullanın: 1. Steril bir 15 ml tüp 4 x 10 9 spheroplastlar 8 x 10 8 boncuk ekleyin. NOT: konsantrasyonu hala 1 × 10 10 sferoplastlar / ml hiçbir hücreler, spheroplasting işlemi sırasında kaybolan olduğunu varsayalım. 4 ml toplam hacmi getirmek için% 0.1 BSA ile 1 x PBS ekleyin. 1 ml'lik dört 1.5 ml tüpler içine kısım. hafifçe dönerken 5 saat boyunca 4 ° C 'de reaksiyonlar inkübe edin. PrPolimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için, boncuk bağlı spheroplastlar epare. 3 dakika boyunca mıknatıs üzerinde kaydırma reaksiyon tüpleri yerleştirin. pipetleme süpernatantı ve 3.2.2.4 Adımları 3.2.2.3 tarif edildiği gibi aynı şekilde,% 0.1 BSA ile soğuk 1 x PBS, buzla Boncuk bağlı spheroplastlar dört kez yıkayın. Damıtılmış H2O 25 ul, her bir tüp içinde, boncuk bağlı spheroplastlar yeniden süspanse -20 ° C'de boncuk saklayın veya 4.3 Adım geçin. boncuk bağlı scFvs'ye için genleri içeren plazmidler yükseltmek için boncuk bağlı spheroplastlar üzerinde tam plazmid PCR gerçekleştirin. Aşağıdaki dizileri ile primerler elde: 5'CCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTG3 '(ileri primer) ve 5'TAGCTCTTGATCCGGCAAACAAA3' (ters primer). NOT: Bu son uca PIMD plazmid karşıt şeritler üzerindeki (Şekil 2) bağlanır ve PIMD ortak bir özelliği tavlanacak şekilde tasarlanmış, bu amplifikasyon bağımsız olarak ortaya çıkarscFv varyantı. primerler fosforile. NOT: fosforilasyon olmadan, yeniden ligasyon meydana gelmeyecektir. Astarlar de oldukça bu protokol bu fosforilasyon yöntemi kullanmak yerine, 5'-fosforilasyon ile sipariş edilebilir. 0.5 ml'lik bir tüp içinde, Tablo 1 'de tarif edildiği gibi ileri PCR primeri için fosforilasyon reaksiyonu başlatacak. Ters primer için bu işlemi tekrar edin. 1 saat süre ile 37 ° C 'de reaksiyonlar inkübe edin. 20 dakika T4 polinükleotid kinaz (PNK) devre dışı bırakmak için daha sonra, 65 ° C'de inkübe. -20 ° C'de fosforlu primerler saklayın. PCR gerçekleştirin. Tablo 2'de tarif edildiği gibi bir PCR tüpü içinde, PCR reaksiyonunu hazırlanması. NOT: Çoklu reaksiyonlar yüksek verim için hazırlanmış olabilir. Kullanılmayan kordon bağlı sferoplastlar -20 ° C'de saklanabilir. Tam lizis sağlamak için, bir termal döngü içinde 15 dakika boyunca 98 ° C 'de, PCR reaksiyonunun ısı spheroplastlar evi. termal döngü tüpleri çıkarın ve her bir yüksek sadakat polimeraz 0.5 ul ekleyin. Termal döngü tüpleri dönün ve Tablo 3'te ayrıntılı programını kullanarak çalıştırın. uygun şekilde PCR ürünleri havuzu. -20 ° C'de saklayın veya 4.4 Adım geçin. Tablo 1. PNK fosforilasyon reaksiyonu (Aşama 4.3.2.1). reaktif Hacim (ul) Damıtılmış H2O 15 10x T4 DNA ligaz reaksiyon tamponu 2 100 uM astar 2 T4 polinükleotid kinaz (PNK) 1 1 "fo: keep-ile-next.within sayfa =": "keep-together.within-page = fo" KBB her zaman "> Tablo 2. Tüm-plazmid PCR reaksiyonu (Adım 4.3.3.1). reaktif Hacim (ul) Damıtılmış H2O 28.5 5x Yüksek sadakat polimeraz tampon 10 10 uM Fosforile ileri primer 2.5 10 uM Fosforile edilmiş ters primer 2.5 40 mM dNTP karışımı (10 mM, her dNTP) 1 Boncuk bağlı sferoplastlar 5 Tablo 3. PCR programı (Aşama 4.3.3.2). <tbody> Adım Sıcaklık (° C) Süre (dk: sn) Döngü sayısı ilk doğasını 98 00:30 1 doğasını değiştirmek 98 00:10 35 tavlama 69 00:30 uzatma 72 KB başına 0:30 son uzatma 72 06:00 1 Ambar 12 Sonsuz 1 Bütün plazmid PCR ürünleri yeniden sirküler ve MC4100 E. dönüştürmek için lige ürün kullanmak coli hücreleri. , Bir agaroz jeli 23 üzerinde PCR reaksiyonu, jel 23 DNA boyama ve kullanılarak PCR ürünü saflaştırmakJel temizleme kiti üretici tarafından sağlanan talimatları izleyerek doğrusallaştırılmış plazmid arındırmak için. 260 nm'de bir spektrofotometre kullanılarak konsantrasyonu ölçümü. gerekli olana kadar -20 ° C'de saflaştırılmış fragman saklayın ya 4.4.2 Adım devam etmektedir. PCR ürünü plazmid yeniden sirküler. Düşük konsantrasyonda 1 ng / PCR ürününün ul 27 bağlanma reaksiyonunun gerçekleştirilmesi, PCR ürünü moleküller ligasyonu önlemek için. Bu konsantrasyonda 800 ul ligasyon reaksiyonu hazırlamak için gerekli hacmi hesaplayın. Buz üzerinde Ligasyon reaksiyonu hazırlayınız. Bir tüp içinde, 800 ul kadar PCR ürününün Aşama 4.4.2.1 hesaplanan hacim 10 x DNA ligaz tamponu 80 ul, damıtılmış H2O ekleyin. T4 DNA ligaz 4 ul ekleyin ve hemen bir su banyosu ya da termal döngüleyici içinde 16 ° C 'de tüpleri. 14 ila 18 saat boyunca 16 ° de CO / N inkübe edin. -20 ° C'de tamamlanan ligasyon reaksiyonları Mağazaihtiyaç kadar, ya da 4.4.3 Adım geçin. DNA ligazı ısı ile inaktive etmek için 15 dakika boyunca 65 ° C'de sıcaklıkta bir blok üzerinde Ligasyon reaksiyonu yerleştirin. Sonra bağlanan DNA-tuz de bir mikrodiyaliz zarı veya DNA temizleme kiti kullanın. 20 ° C'de saklayın veya 4.4.4 Adım geçin. MC4100 E. dönüştürmek için tüm ısı ile inaktive, de-tuzlu ligasyon ürünü kullanın coli hücreleri 23. -80 ° C 'de elde edilen büyütülebilir alt kütüphanesi içeren hücrelere ve mağaza alikotları, Aşama 1.3 de tarif edildiği gibi, gliserol stokları hazırlayın. alt kütüphanesi ikinci kaydırma yapmak için Aşama 4.4.4 elde edilen bir alikot ile bütünüyle tekrar 4. Adım. NOT: İkinci bir kaydırma hedef antijene 19 iyi bağlanan kütüphane bileşenleri için zenginleştirmek yardımcı olur. 5. daha fazla karakterizasyon için ümit vaat eden klonları tanımlamak için (Şekil 5), bir enzime bağlı immünosorbent analiz yöntemi kullanılarak ikinci bir ekran gerçekleştirme </P> Şekil 5. ELISA bazlı bir eleme (Aşama 5). Kaydırma esnasında zenginleştirilmiş alt kütüphanesi (A) Kütüphane varyantları büyüme ve ifade için bir kültür plakasının her bir gözeneğinden aşılanmıştır. (B) bir ELISA plakası, hedef antijen ile kaplanmıştır. (Cı) kütüphane varyantları protokolde tarif edilen ELISA bazlı bir ekran kullanılarak taranır. İkinci ekrana elde edilen verilerin Analiz yapıldığında, ilgi konusu varyantları seçilir ve daha da karakterize edilmiştir. Protokol adımlar belirtilmiştir tekabül etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. LB agar plakaları üzerine ve levha (Kademe 4.4.4 arasında) büyütülebilir alt kütüphanesi bir tüp çözülme. Levha bir kaç sulandırma,(- 10 6 kat dilüsyonları örneğin, 10 2) bireysel koloniler sağlamak için yeterli düşük konsantrasyonlarda. 37 ° C'de 15 saat 18 için inkübe edin. 4 ° C'de plakaları saklayın ya da 5.2 Adım geçin. panned alt kütüphanesi gelen Kültür ve teşvik koloniler. steril şartlar altında tüm adımları uygulayın. 96 gözlü levhalar içine alan aşamalar için çok kanallı bir pipet kullanın. Bir yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna 20 ug / ml Cm LB 200 ul ekle. Bir pipet ucu ile agar plakasından bağımsız bir koloni seçin 96 oyuklu plakanın ilk kuyudaki ucu ve yavaşça aşılamak için karıştırın. her bir kuyu için yeni bir uç kullanın. her bir kuyunun içine bir koloni aşılamak. Bir kontrol olarak, en az bir sterilite kontrolü de inoküle Resim koloni bulunmaktadır. Tekrar Adım 5.2.1 ve 5.2.2 çok 96 oyuklu plakaların aşılanması için. 310 rpm'de bir mikro-plaka karıştırıcısı üzerinde 96 gözlü levhalar yerleştirin. 37 ° C'de inkübe edin6; 20 saat 24 C scFv'leri ifade etmek. Aşama 5.2'de hazırlanan her bir kültür plakasına, kaplama, hedef antijen ile bir 96-çukurlu ELISA plaka için. Kaplama çözeltisinin yapılması için 1 x PBS içinde uygun bir konsantrasyonda (4 ug / ml, örneğin, 1 ug / ml), saflaştırılmış hedef antijeni seyreltilir. Her bir 96-delikli plaka için kaplama çözeltisinin 5 ml olun. NOT: uygun konsantrasyon kullanılan spesifik antijen bağlıdır ve ayarlanması gerekebilir. 96 oyuklu yüksek bağlama açık bir polistiren ELISA plakasının her oyuğuna kaplama solüsyonu 50 ul ekle. Beher kuyudan yavaşça tüm yüzeyi kaplanmış olduğundan emin olmak için tezgah üstü yüzeyi üzerinde plaka hafifçe vurun. Her plaka için tekrarlayın. 4 ° CO / N plakaları inkübe edin. agar plakları üzerine 96-yuvalı kültür plakaları koloniler çoğaltır. Sıvı sabun, az miktarda toplamak için bir kültür plakasının yuvaları içine steril polistiren çoğaltıcısının yerleştirinİD. Dikkatle çoğaltıcısının yükseltmek ve tüm ipuçları plaka dokunmadan böyle bir 15 cm LB agar plaka transfer. Sıvı transfer edildikten sonra, doğruca yukarı çoğaltıcısı kaldırın. Her kültür plaka için tekrarlayın. Daha fazla karakterizasyon isteniyorsa 96 oyuklu plaka içerisinde ikinci bir ekran sonuçları, plakasında doğru çoğaltılmış kolonisi ile uyumlu şekilde, doğru bir yönlendirme ile agar plaka etiketleyin. 15 saat 18 süreyle 37 ° C'de büyütülmüştür ve gerekli olana kadar, 4 ° C'de depolayın. ELISA ikincil ekran gerçekleştirin. 1 x PBS içinde kuru süt (ağırlık / hacim)% 2 yaparak bloke çözeltisi hazırlayın. ELISA plakaları kaplama çözümü boşaltın. Her bir oyuğa bloklama çözeltisi 100 ul ekle. 4 ° C'de en az 2 saat ya da blok olarak O / N, oda sıcaklığında inkübe edilir. 1 x PBS içinde% 0,05 nihai konsantrasyona polisorbat 20 ilave edilerek yıkama tamponu hazırlayın. ELISA plakasına 250 ml yapmak. Bir 20 ul ekleKonsantre hücre lisis yuvarlak tabanlı kültür plakasının her bir oyuğuna, deterjan ve 15 ila 20 dakika boyunca oda sıcaklığında bir mikro-plaka çalkalayıcıda kültürü plakası kuluçkalayın. parçalama ve yıkama adım 5.5.4 aynı anda gerçekleştirilir, böylece ELISA plakaları bloke tamamlandığında, aynı zamanda lizis başlayın. ELISA plakaları engelleme çözümü boşaltın. yıkama başına oyuk başına yıkama tamponu 200 ul bloke ELISA plakaları dört kez yıkayın. Kuyulardan yıkama tamponu boşaltın. her bir için yeni bir uç ile, ELISA plakasının karşılık gelen transfer hücre parçalama bir levhanın her çukuruna 50 ul. 1 ila 2 saat boyunca oda sıcaklığında ELISA plaka inkübe edin. bağlı scFv'leri algılamak için antikor çözeltisi hazırlayın. bir yaban turbu peroksidaz (HRP) kitaplığı scFv'den kaynaşmış FLAG epitop takısına bağlanan primer antikor ile konjüge edilmiş kullanın. (ELISA kullanmak tedarikçi & # görmek için uygun seyreltme antikor sulandırmak39;% 2 tavsiyeleri) (1 x PBS içinde% 0,05 polisorbat 20 / hac) kuru süt ağ. Her bir plaka için 5 ml hazırlayın. Aşama 5.5.4 de tarif edildiği gibi ELISA plakalar, yıkama tamponu ile dört kere yıkanır. ELISA plakasının her oyuğuna antikor çözeltisi 50 ul ekle. Oda sıcaklığında 1 ila 2 saat süreyle inkübe edin. Işık kaçınarak üreticinin protokolü damıtılmış H2O O -fenilendiamin dihidroklorid (OPD) tabletlerinin çözülmesiyle HRP substratı hazırlayın. ELISA plaka başına 20 ml hazırlayın. Gerektiği gibi distile H2O ile konsantre H 2 SO 4 seyrelterek 3 MH 2 SO 4 hazırlayın. ELISA plaka başına 5 ml hazırlayın. Dikkat: H 2 SO 4 güçlü bir asittir. Uygun kişisel koruyucu ekipman giymek emin olun. Aşama 5.5.4 de tarif edildiği gibi, yıkama tamponu ile ELISA plakaları dört kez yıkayın. HRP substra ELISA inkübe edinte. Her bir oyuğa HRP alt-tabaka 200 ul ekle. , Işığa maruz kalma minimize seferinde bir ELISA plakasına substrat ekleyin ve sonraki plaka geçmeden önce, alüminyum folyo ile sarılır. karanlıkta, oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika boyunca inkübe edin. İlk 30 dakika sonra, alt-tabakanın kararması plakaları kontrol ve renk geliştirme görselleştirmek için gerekirse daha inkübe edilir. Reaksiyonun sönmesi için her bir oyuğa 3 MH 2 SO 4 50 ul ekle. Her bir kuyu için farklı bir ucu kullanarak köpürme olmadan yavaşça yukarı pipetleme ve aşağı kuyularda çözüm karıştırın. Tutarlılık ve doygunluk önlemek için, her plaka için çözüm karıştırmadan önce ELISA plakaları tüm SO 4 hızlı ve dikkatli H 2 ekleyin. Bir plaka okuyucusu kullanılarak 492 nm de her bir levhanın gözleri içine çözeltinin absorbansı ölçülür. scFv bu exhib varyantları tanımlamak için absorbans verileri analizo bağlayıcı sinyalleri umut verici ve bu umut verici scFv'leri karakterize. Her plaka üzerinde ortalama sinyal daha arka plan sinyalinden daha yüksek ve daha yüksek absorbans sinyalleri sergileyen scFv'leri seçin. Not: emme düzeyi tarama izole edildi scFv varyantlarının gücü ile birlikte kullanılır antijen ve anti-FLAG antikor özelliklerine bağlı olacaktır.