التصحيح تسجيلات المشبك على سليمة الظهرية جذر العقد من الجرذان الكبار
概要
This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.
Abstract
دراسات المشبك التصحيح من العقد الجذرية الظهرية (DRGs) الخلايا العصبية زادت فهمنا للنظام العصبي المحيطي. حاليا، تجري معظم التسجيلات على الخلايا العصبية DRG فصل، وهو إعداد القياسي لمعظم المختبرات. خصائص الخلايا العصبية، ومع ذلك، يمكن أن تتغير من إصابة محور عصبي الناتجة عن الهضم انزيم المستخدمة في الحصول على الخلايا العصبية فصلها. وعلاوة على ذلك، يمكن أن الاستعدادات الخلايا العصبية نأت لا تمثل تماما المكروية من DRG منذ فقدان الاتصال مع الخلايا الدبقية الأقمار الصناعية التي تحيط الخلايا العصبية الحسية الأولية هي نتيجة لا مفر من هذا الأسلوب. للتغلب على القيود في استخدام الخلايا العصبية DRG فصل التقليدية للتسجيلات المشبك التصحيح، في هذا التقرير ونحن تصف طريقة لإعداد DRGs سليمة وإجراء التسجيلات المشبك التصحيح على الفردية الخلايا العصبية الحسية الأولية المجراة سابقا. يسمح هذا النهج إعداد سريع ومباشر من DRGs سليمة، ومحاكاة فيفيفو الشروط عن طريق الحفاظ على الخلايا العصبية DRG المرتبطة خلاياها الدبقية الأقمار الصناعية المحيطة والغشاء القاعدي. وعلاوة على ذلك، فإن الطريقة يتجنب إصابة محور عصبي من التلاعب وانزيم الهضم مثل عندما النأي DRGs. بالإضافة إلى ذلك يمكن إعداد هذا المجراة سابقا أن تستخدم لدراسة التفاعل بين الخلايا العصبية الحسية الأولية والخلايا الدبقية الأقمار الصناعية.
Introduction
الإحساس هو ضروري لبقاء الكائن الحي والرفاه. نقل المحفزات يعتمد على المسارات الحسية ابتداء من النهايات الطرفية من المحاور من الخلايا العصبية الحسية الأولية. الخلايا العصبية الحسية الأولية، مع استثناء من نواة الدماغ المتوسط للعصب مثلث التوائم، وتقع في مثلث التوائم العقد والجذر الظهري العقد (DRGs). وهي بمثابة حراس المعلومات الحسية 1. في غشاء perikarial، تماما كما في المحطات المركزية والطرفية، والخلايا العصبية DRG تعبر عن مستقبلات والقنوات الأيونية، مثل مستقبلات الغلوتامات، TNF مستقبلات ألفا، مستقبلات عابرة المحتملين قناة الموجبة أعضاء فصيلة V 1 (TRPV1)، وقنوات الصوديوم، الخ 2 -7. التسجيلات المشبك التصحيح في الغشاء perikarial تسمح فهم التغيرات الوظيفية للعديد من هذه المستقبلات والقنوات في جميع أنحاء الخلايا العصبية.
تقنية تسجيل المشبك التصحيح هو أداة قوية لستوالموت أنشطة القنوات أو مستقبلات وعدد كبير من الدراسات قد أجريت من خلال تطبيق هذه التقنية على الخلايا العصبية DRG 8-10. في معظم الدراسات إزالة DRG عن طريق خفض rootlets ظهري وعلى مقربة العصب الشوكي إلى العقدة. بعد تنميق، ثم يتم وضع العقدة في الانزيمات الهاضمة التي تؤدي إلى تفكك الخلايا العصبية DRG، والتي يمكن بعد ذلك يتم تسجيلها على الفور أو مثقف لعدة أيام قبل التسجيل. للأسف، تفكك الخلايا العصبية DRG ينطوي على axotomy الضروري على مقربة من perikarya. مرة واحدة فصل وaxotomized، الخلايا العصبية DRG تخضع التغيرات المظهرية وكذلك التغيرات في غشاء استثارة 11،12. فقدان الاتصال بين perikarya من الخلايا العصبية الفردية والخلايا الدبقية الأقمار الصناعية التي تحيط عادة لهم ومن المرجح أن يسهم في هذه التغيرات 13. الحديث المتبادل بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الأقمار الصناعية على حد سواء أساسيا في الظروف الفسيولوجية وفي مجال التكيف مع pathologشروط كال مثل تلك التي تؤدي إلى آلام مستعصية على الحل 14،15. وسيكون تحديا لدراسة التفاعل بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الأقمار الصناعية باستخدام إعداد DRG فصلها.
DRGs سليمة، من ناحية أخرى، توفر أقرب إلى الأوضاع في الجسم الحي. في السنوات القليلة الماضية، مختبرنا، وكذلك بعض المجموعات الأخرى، وقد تم استخدام DRGs سليمة من الفئران البالغة لتحقيق التغييرات من الخلايا العصبية الحسية الأولية في ظروف مختلفة تترافق مع الألم المزمن 3-5،11،15-17. على الرغم من أن التقنيات المستخدمة في هذه الدراسات يتم تأسيس نوعا ما، لم يتم بعد نشر وصفا خطوة بخطوة. في هذا المخطوط، وصفنا وسيلة مريحة وسريعة لإعداد DRGs سليمة واستخدامها للحصول على تسجيلات المشبك التصحيح.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن الإبلاغ عن طريقة لإعداد DRGs كاملة للدراسات المشبك التصحيح. وهناك العديد من العناصر الأساسية لإعداد نموذج مثالي. أولا، من المهم أن تشريح DRGs مع الجذور الظهرية المرفقة. بعد ذلك، غلاف تحتاج إلى إزالتها بعناية مع تجنب الأضرار التي لحقت الخلايا العصبية. وأخيرا، لفضح ال?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.
Materials
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 u/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
参考文献
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139, 267-284 (2009).
- Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia. Pain. 157, 147-158 (2016).
- Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury. PloS one. 9, 95491 (2014).
- Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha. Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).
- Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord. Spine. 29, 1082-1088 (2004).
- Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain. Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).
- Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).
- Dib-Hajj, S. D., et al. Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain. Pain. 83, 591-600 (1999).
- Cummins, T. R., et al. A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons. J Neurosci. 19, RC43 (1999).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just ‘rings around the neuron’. Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).
- Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis. 神経科学. 288, 51-58 (2015).
- Zhang, H., et al. Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia. Glia. 57, 1588-1599 (2009).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).
- Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression. J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).
- Sherman-Gold, R. . The Axon Guide. , (2008).
- Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons. Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).
- Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).
- Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons. J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).
- Funakoshi, K., et al. Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs. Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Yagi, J., Sumino, R. Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).
- Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons. J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).
- Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).
