Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.
The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.
Die Angiogenese wird durch extrazelluläre Signal Cues ausgelöst, die Endothelzellen (ECs) fördern zu polarisieren, wandern mit Richtungs Spezifität und neue Gefäße in Gewebe bilden, die Blutversorgung. Dazu tragen gedacht, um die Angiogenese fahren sind Signale von der extrazellulären Matrix (ECM). Als Reaktion auf körperliche Signale erstrecken ECs neue Zweige mit Richtungsspezifität Richtungsbewegung in die Bildung des vaskulären Netzwerks 1,2 zu führen. Die Architektur der EG – Morphologie und Verzweigung wird durch lokale Regelung der Mikrotubuli (MT) Zytoskelett in einer Weise definiert , die mit der Regulierung von ACTO-Myosin Kontraktilität 3 koordiniert wird. Damit Zweige EG, Myosin-II lokal herunter reguliert werden müssen , zu bilden, was zu einer lokalisierten Membranausstülpungen 4. Zur gleichen Zeit und am gleichen Ort innerhalb der Zelle geworden MT Wachstumsdynamik verändert in langsame und anhaltende MT Wachstum resultierende Zweig elon zu fördernsuchung und Stabilität 5. Diese koordinierte Zytoskelett-Regelung erlaubt ECs ihre Morphologie zu polarisieren gerichtete Migration zu erleichtern.
Die Entwicklung eines polarisierten Zellmorphologie erfordert polarisiertem MT Anordnung 6. In der Migration Epithelzellen wachsen MTs langsam und beharrlich speziell an der Vorderkante der Zelle 7-9; während in Neuronen erfordert die Initiierung und Dehnung von Axonen und Dendriten , dass MTs nicht nur vorhanden sind, sondern dass sie durchlaufen dynamisch die Prozesse der Montage und Demontage 10-15. Auf diese Weise lokalisierte Steuerung der Wachstumsdynamik MT bestimmt die Architektur der Zelle und ermöglicht eine schnelle Remodellierung der Zellmorphologie als ECs durch ihre ECM navigieren.
MT Wachstumsdynamik von Familien von molekularen Motorproteinen und nicht-Motorproteine reguliert werden, sogenannte Mikrotubuli assoziierte Proteine oder Mikrotubuli interagierender Proteine (von nun an RefeRred als MAPs). MAPs kann vor Ort aktiviert oder inaktiviert werden, in der Regel durch Signalkaskaden an der Zell-ECM – Schnittstelle 16,17 initiiert. Sobald er aktiv ist, MAPs Funktion zum MT durch die Bindung und die Kinetik der MT Montage und Demontage zu verändern; dadurch funktioniert lokal MT Dynamik regeln , um 18 bis 20 Zellform und Polarität zu fördern. Mitotischen Zentromer Assoziierte Kinesin (MCAK) ist ein Kinesin-13 Familie MAP , die 21-23 MT Demontage MT Enden und Paare ATP – Hydrolyse bindet. Diese funktionelle Rolle von MCAK ist bekannt in der mitotischen Spindel 24-28 kritisch zu sein, wie auch während der Inter 29,30. Innerhalb der Interphase ECs wird MCAK-vermittelte MT Demontage durch lokalisierte Aurora-A induzierte Phosphorylierung von MCAK als Reaktion auf Wundrand induzierte Aktivierung des Rac1 kleine GTPase geregelt. Das Ergebnis dieser Signalkaskade ist die Hemmung der MCAK an der Vorderkante von ECs, was zu polarisiertem MT Wachstum in Richtung leading Rand und MCAK-induzierte MT Demontage an der Hinterkante von 31 ECs migrieren.
Traditionelle Methoden zur MT Wachstumsdynamik Messung haben typischerweise Handverfolgung entweder fluoreszierend markierten Tubulin oder, in jüngerer Zeit, fluoreszenzmarkierte MT End binding protein 1 oder 3 (EB1 oder EB3, respectively) verwendet. Der fluoreszierende Tubulin Ansatz hat den Vorteil, dass der gesamte MT Array Beschriftung. Da jedoch die meisten mitotischen Zelltypen eine radiale Anordnung von MTs während der Inter 8,32,33, MTs in der Nähe der Zentrosomen halten sind sehr dicht, und als Ergebnis, MT Wachstum und Abbau mit fluoreszierenden Tubulin Tracking ist in der Regel auf die Umfangs begrenzt Regionen der Zelle. Aufgrund dieser Einschränkungen, die Verwendung von fluoreszenzmarkierten EB-Proteine (EB1 oder EB3) die häufigere Ansatz MT Dynamik zu messen war. Denn nur EBs die wachsenden Plus-Enden von MTs beschriften, erscheinen sie als kleine (1-3 & mgr; m), hell fluoreszierende komments, also mit sehr begrenzten Hintergrundfluoreszenz 34-37 eine leicht unterscheidbare Marker der MT Polymerisation bereitstellt. Während die Tatsache, dass nur EBs Etikett eine Teilmenge des MT-Array eine große Stärke des Ansatzes EB darstellt, auch sie eine wichtige Einschränkung betont werden, dass nicht wachsenden MTs nicht vom EB3 Ansatz gekennzeichnet. Dennoch ist die Fähigkeit zu messen und EB3 Kometen im Laufe der Zeit zu verfolgen und MT Wachstum innerhalb subzellulärer Regionen zu visualisieren machen diesen Ansatz ideal für Anwendungen, die regionale Auswertung der MT Organisation erfordern.
Eine andere kritische Einschränkung der herkömmlichen Methoden zur Messung MT Wachstumsdynamik hat sehr große Datenmengen, und die Zeit für die Datenanalyse erforderlich. Diese Einschränkung ergibt sich aus der Notwendigkeit, das Handtracking von Hunderten von EB Kometen mit hoher Zeitauflösung. Darüber hinaus müssen diese Messungen in einer statistisch signifikanten Anzahl von Zellen und auch unter einer Vielzahl von Steuer- und Experime durchgeführt durchgeführt werdenntal Bedingungen. Vor kurzem haben diese Einschränkungen durch rechnerische Analysetechniken überwinden speziell bei Tracking EB3 Kometen mit Zeitraffer-Mikroskopie in lebenden Zellen 35 gerichtet. Bei richtiger Anwendung dient diese Rechenansatz sowohl das Potential für menschliche Fehler, die mit der Hand-tracking zusätzlich zur Bereitstellung eines Hochdurchsatzverfahren zur Messung der MT Polymerisation beschränken. Rechnerische Analyse von MT Dynamik der MATLAB-basierten Software – Paket, plusTipTracker, ermöglicht Messungen von MT Wachstum von fluoreszenzmarkierten EB3 Kometen 5,31,35,38 Tracking. Zusätzlich ermöglicht plusTipTracker Software zur Berechnung von Katastrophenereignisse MT (aka Demontage) , basierend auf dem Verschwinden des EB3 Kometen in einem wachsenden MT Spur und ermöglicht subzellulären (aka regional) Analyse der MT Wachstumsdynamik innerhalb benutzerdefinierten interessierenden Bereiche . Für unsere Studien wurden MT Wachstumsdynamik im Vergleich innerhalbverzweigte Regionen im Vergleich zu nicht-verzweigte Regionen oder im Vergleich zu Hinterzellkanten innerhalb führt. Datenausgabe von plusTipTracker Software kann auch farbcodierte Spur Overlays für einzelne Zellen verwendet werden und subzellulären Regionen zu generieren.
Hier beschreiben wir die Methode, nach der die Rolle der MCAK untersuchen bei der Modulation der Dynamik MT Wachstum und den Beitrag dieses MT Depolymeraseaktivität zur Regulierung der EG-Morphologie und gerichtete Migration Verzweigung. Unser Ansatz verwendet, um einen primären humanen Zelllinie, menschliche Endothelzellen aus der Nabelvene (HUVECs), die leicht kultiviert werden und sehr zugänglich für die Elektroporation-induzierte, transiente Transfektion von Plasmid-cDNA. Wir haben dann verwendet hochauflösende, Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie von HUVECs mit MT End transfizierten Protein Binding 3 (EB3) und mitotischen Zentromer Assoziierte Kinesin (MCAK) -spezifischen cDNA-Konstrukte Auswirkungen auf MT Dynamik zu bewerten HUVECs transfiziert. PlusTipTracker-basierte Rechenbildanalyse von EB3-markierten MT Plusenden war MT Wachstumsgeschwindigkeiten und MT Wachstum Lebensdauer im Zeitraffer Bilder, zu messen und zu vergleichen Effekte der experimentellen Manipulationen auf MT Wachstumsdynamik zu messen. Diese Methodik ermöglicht die Untersuchung der Dynamik MT und der Identifizierung, wie lokalisierte Regulierung der MT Dynamik innerhalb subzellulären Regionen trägt zu den angiogenen Prozessen der EC Verzweigung und Migration. Diese Techniken sind für Untersuchungen von jeder Karte, die fluoreszenzmarkierten und ausgedrückt in lebenden Zellen werden kann.
Mit HUVECs in Morphologie und Migration Experimente.
Abbildung lebender Zellen von EB3-markierte MT Wachstumsdynamik innerhalb HUVECs erfordert angemessene und reproduzierbare Zellkulturbedingungen, um zu messen und zu bewerten Veränderungen in MT Wachstum und HUVEC Morphologie, so dass sie dann zu einem ECM-Signalisierungs Cue zugeordnet werden. HUVECs stellen ein hervorragendes Modell der Zellform und Beweglichkeit für das Studium. Sie sind sehr zugänglich für die Transfektion mit fluoreszenzmarkierten cDNAs sie dramatische Morphologien als Reaktion auf sowohl lösliche als auch physikalische Signal Cues aufweisen, und sie behalten die Fähigkeit , sich in vaskuläre Röhren zu organisieren , wenn 65-70 geeignete Zellkulturbedingungen zur Verfügung gestellt. Primäre Zellkulturen, wie HUVECs, erfordern eine sorgfältige Handhabung und Überwachung von Zellpassage Nummer, um die Zellen gesund sind, um sicherzustellen, und dass sie sich verhalten normalerweise während der Experimente. Wenn beispielsweise die Durchführung von Experimenten untersucht cytoskeleton und / oder die Zellmorphologie, HUVECs sollte nicht für Experimente über den zehnten Zellkulturdurchgang verwendet werden, wie HUVECs typischerweise beginnen ungleichmäßigen Morphologien herum Passage zwölf bis fünfzehn anzuzeigen.
Zelldichte ist auch ein kritischer Regulator der HUVEC Gesundheit und Proliferation. HUVEC Verzweigung Untersuchungen (siehe Protokoll 10,1-10,4 oben) verwenden relativ niedrige Zelldichte Kulturen, um die Zellen physischen Raum zu schaffen, mit ihren ECM zu interagieren und verzweigte Vorsprünge zu verlängern. Im Gegensatz dazu ist der Migrationsforschung in der Wundrand (siehe Protokoll 10,5-10,8), HUVECs sind Kultur in einer Monoschicht vor der Verletzung. Als solche Wundrand HUVECs eine relativ unverzweigten Morphologie zeigen, erstrecken sich Kantenvorsprüngen führt, und zeigen Zell-Zell-Interaktionen mit ihren unmittelbaren Nachbarn, wie sie in die Wunde wandern.
Caveats und Vorteile von Tracking-MT Dynamics in Wohn HUVECs.
Spinning Disk-Mikroskopie ist ein ausgezeichneter Ansatztesten experimentelle Hypothesen, die konfokale Bildklarheit mit hoher Zeitauflösung erfordern. Mit der entsprechenden Kamera und Lasermodul dieser Mikroskopie Ansatz ist empfindlich gegenüber niedriger Emission Fluoreszenz und kann in reduzierten Photobleaching im Vergleich zu anderen Arten von Fluoreszenzmikroskopie unterstützen. Wichtig ist, dass dieser Ansatz auch gut für mittlere bis hohe Zeitauflösung Bildgebung geeignet, da zur Erzeugung umfassende Messungen von MT Wachstumsdynamik mit dem EB3 Label-Ansatz, in einer Vielzahl von verschiedenen Zelltypen erforderlich ist.
Während die EB3 Methodik zur Etikettierung wachsenden MT Plus-Enden deutliche Vorteile gegenüber anderen Methoden der Fluoreszenzmarkierung MTs aufweist, hat es auch eindeutige Nachteile auf. Zum Beispiel gibt es einen Anteil des MT – Array , das zu einem gegebenen Zeitpunkt nicht aktiv wachsenden wird einschließlich sowohl der Population von Auseinanderbauen MTs und der Population von stabilen, nicht-dynamischen MTs 71-74. EB3 würde diese zwei Populationen von MTs nicht beschriften undDaher ist der Beitrag dieser beiden Populationen nicht in experimentellen Datenanalyse einbezogen werden. Alternative Methoden für die gesamte MT Array Auswertung wurden auf die Expression von fluoreszenzmarkierten Tubulin fokussiert, die in allen Populationen von MTs enthält und ermöglicht Identifizierung wachsen, schrumpfen, und stabile MTs. Jedoch wegen der relativ hohen Dichte des MT-Array in der Nähe der Mitte der Zelle und neben dem Mtoc (MTOC), das gesamte MT-Array Markierung erzeugt ein Nachteil bei der Durchführung der Bildanalyse von MT Enden, die nicht in der Nähe der Zelle Peripherie 75-77. Experimente unter Verwendung von Zweifarben – co-Markierung von MTs mit fluoreszierenden Tubulin und fluoreszierende EB3 in lebenden Zellen haben gezeigt, qualitativ, dass die überwiegende Mehrheit der Tubulin-markiertem MTs auch EB3-markiertes 78. Darüber hinaus hat es kein effizientes Verfahren zur automatischen Verfolgung von MTs mit fluoreszierenden Tubulin markiert worden. Dies bedeutet, dass die Daten KollHand Verfolgung einzelner MTs tion und Messungen der MT Dynamik in Zellen benötigen fluoreszierendes Tubulin exprimieren, ein Prozess, fehleranfällig und mühsam ist. Als Ergebnis hat die automatisierte Computeranalyse von EB3 markiertem MTs die bevorzugte Methode werden zur Messung MT Dynamik wie es Dynamik MT Experimente angewendet werden kann auf zahlreiche Zelltypen und in einer Vielzahl von experimentellen Regimen 35,79.
Die Verknüpfung MT Wachstumsdynamik zu HUVEC Morphologie und Migration.
Aus der Sicht eines Zytoskelett Ermittler, eine äußerst nützliche Anpassung der plusTipTracker automatisierten Tracking-Analyse ist die Fähigkeit, sowohl ganze Zelle und regionale Veränderungen in MT Wachstumsdynamik zu messen und zu bewerten. Die Anforderung für eine Zelle polarisiert zu werden, ist eine wesentliche Voraussetzung für die Richtungszellmigration. Als solche haben polarisierte Signal Cues lange Schlüsselfaktoren für die gerichtete Zellmigration bekannt 30,31,51,54,56,80,81 </sup>. Beispielsweise lösliche Signalmoleküle wie VEGF Aktin – Polymerisation und MT Wachstum in Richtung der VEGF cue in endothelialen Zelltypen 2,82-87 induzieren. Zusätzlich kann in Reaktion auf physikalische Wechselwirkungen mit dem ECM (beispielsweise Compliance und Dimensionalität mechanosensing) modulieren HUVECs ihre MT Dynamik durch örtliches Regulieren MAPs MT Wachstum zu fördern verzweigten Vorsprünge innerhalb verlängernden, und dies dient HUVEC Migration in Richtung der Führung Stichwort 5,31,88. Somit Polarisation in Reaktion auf extrazelluläre Signalisierungs cues unterstreicht die Notwendigkeit für experimentelle Bewertung von lokalisierten Veränderungen in Zytoskelett-Dynamik.
Gleichzeitige Live-Cell-Imaging von MT Wachstumsdynamik (mit dem EB3-Ansatz) und HUVEC Zellmigration ist extrem schwierig durchzuführen, weil MTs auf einer Zeitskala von Sekunden wachsen, während Veränderungen der Zellmorphologie und gerichtete Migration auf einer Zeitskala von Stunden auftreten. Doch beide Prozesse sind eng LINKEd. Außerdem führt kontinuierliche, schnelle Bildgebung von fluoreszenzmarkierten EB3 auf der zweiten Zeitskala des EB3 Signal Photobleaching. Versuche, dieses Problem zu überwinden, indem kurze Abbildungsreihe EB3 (1-2 min Akquisitions Serie) alle 30 Minuten waren erfolgreich leitend, jedoch nur in einer kleinen Anzahl von ECs erreicht werden könnte, der eine optimale Expression EB3 hatte und daß keine nachteiligen haben anzuzeigen Auswirkungen auf wiederholte Laserbeleuchtung 5.
Ein alternativer Ansatz, der für Interpretationen , wie MT Wachstumsdynamik beitragen zu Veränderungen der Zellmorphologie und Migration ermöglicht die plusTipTracker Region of Interest (ROI) Werkzeug 35 (siehe Protokoll 6.6). Diese Methode ermöglicht eine ganze Zelle MT Wachstum Spuren unterteilt in benutzerdefinierten Regionen zu sein, von dem Spuren MT Wachstum können dann extrahiert und analysiert werden. Beispielsweise Vergleiche von "verzweigten" versus "nicht verzweigte" Regionen der Zelle haben gezeigt, dass mehr MTs s wachsenNiedrigen und persistent innerhalb verzweigten Regionen im Vergleich zu dem nicht verzweigten Zellperipherie 5. In polarisiert Wundrand HUVECs, Vergleiche der Vorderkante und Hinterkante Wachstumsdynamik MT zeigte, dass MCAK-induzierte MT Demontage innerhalb der Vorderkante spezifisch gehemmt wird, aber nicht die Hinterkante. Regional Bewertung der Vorder- und Hinterkante MT Wachstumsdynamik in HUVECs exprimierenden Rac1 und / oder Phosphorylierung Mutanten von MCAK ergab ferner, dass Rac1-induzierte Aktivierung von Aurora-A-Kinase gezielt und lokal MCAK Aktivität innerhalb der Vorderkante verhindert HUVEC Polarisation und gerichtete Migration zu fahren 31. So hat die Kombination von automatisierten Verfolgung von MT Wachstumsdynamik und regionale Bewertung der MT Wachstumsdynamik innerhalb der verzweigten Vorsprünge und / oder der Vorderkante der Wundrand HUVECs erlaubt uns MT Wachstumsdynamik zu HUVEC Morphologie und Migration zu verknüpfen.
Die Protokolle beschrieben sind designed, um eine im Allgemeinen einfach und hoch reproduzierbare Methodik für HUVEC Kultur und experimentelle Untersuchung. Dennoch sind viele der Protokolldetails komplex und zeitaufwendig, was sich wiederum Gelegenheit für Fehler oder Schwierigkeiten stellt die experimentelle Methodik in der Durchführung. Während es wurde versucht, mögliche Probleme während des gesamten Protokolls, hier ist eine zusätzliche, detaillierte Fehlersuche von möglichen Problemen zur Verfügung gestellt, die weniger verbreitet sind oder in anderer Weise als Noten innerhalb der Methodik Protokolle abgekürzt.
Bezogen auf Beschichtung Deck mit Polyacrylamid-Substrate (Protokoll 2.2), ein häufiges Problem, das Glasplättchen der Aktivierung ist die komplexe Natur entsteht, Kupplung Polyacrylamid auf das Glas, Aktivierung Polyacrylamid und dann ECM Kopplung mit dem Polyacrylamid. Ein besonders schwierig und möglicherweise problematischen Schritt wird die Kultivierung HUVECs auf die Fibronektin / Polyacrylamid-Gel nach der Exposition des polyacrylamide-beschichtete Deckgläser bis 2 mM Sulfo-SANPAH (Schritt 2.2.2.6, oben). Es ist entscheidend für den Erfolg von HUVECs auf diesen Substraten die Kultivierung, die Sulfo-SANPAH vollständig aus dem experimentellen System folgende ECM Konjugation entfernt werden. Dies kann am besten dadurch erreicht , mit ddH 2 O Waschen und Inkubation der Deckgläser in ddH 2 O auf einem über Nacht Schüttler. Wenn Zellen, die auf den Polyacrylamid ECMs nicht überleben, oder wenn die Lebensfähigkeit geringer ist als erwartet, erhöht, und wiederholtes Waschen von Sulfo-SANPAH nach Konjugation an Fibronektin (Schritt 2.2.2.9) empfohlen wird, um potenziell dieses Problem lindern.
Verwandt Protocol 3 (cDNA-Transfektion und HUVEC Kultur auf einem Deckglas), ist ein großer Einfluss auf den Erfolg der Elektroporation Verfahrens die Handhabung der HUVECs sowohl während Trypsinisierung der Zellen sie aus dem Kunststoffkolben zu entfernen, und nach Abschluss die Elektroporation (Schritte 3,3-3,4, oben). Es ist wichtig, zu kümmernvollständig die HUVECs überwachen, während in Trypsin und nicht die Zeit für die Zellen "round-up" auf der Oberfläche des Kolbens (typischerweise 1-2 min) erforderlich, um nicht überschreiten. Zu viel Zeit in Trypsin ist eine Hauptursache für Tod HUVEC, die typischerweise nicht realisiert ist, bis die Zellen an Fibronektin-beschichtete Deckgläser plattiert sind (Schritt 3.4) und sie dann nicht an dem Substrat zu befestigen.
Von ähnlicher Bedeutung, HUVECs (und die meisten primären Zelltypen) nicht gut gehen, wenn für lange Zeit in der Elektroporation Puffer suspendiert. Bei größeren Maßstab Experimenten beispielsweise, wo der Benutzer über fünf oder mehr Bedingungen, die Elektroporation erfordern, ist es besser, um die Zellen in einzelnen Rohren (1 Röhrchen pro Transfektion) pelletiert halten und sie zu mischen, one-at-a-time , in der Elektroporations-Puffer unmittelbar vor der Elektroporation. Dieser Ansatz minimiert Inkubationszeit in Elektroporationspuffers und maximierte HUVEC Überleben. Zusätzlich sofortige Rettung in kompletten Kulturmedien ist auch crtische nach der Elektroporation. Rettungs Verzögerungen von einer Minute oder mehr nach der Elektroporation kann in nahezu vollständigen HUVEC zum Tod führen und sollte daher vermieden werden.
Verwandte Zellmigrationsassay (Protocol 9), die Technik der HUVECs mit extrem hoher Dichte Züchten hängt von einer kritischen Änderung (in Schritt beschrieben 9.2) der traditionellen HUVEC-Zellkulturmethode (beschrieben in Protocol 3), das Trocknen des mit Fibronectin beschichteten Deckglas erfordert um HUVEC Kultur in einen sehr kleinen Bereich des Deckglases zu ermöglichen. Oft, wenn das Deckglas nicht vollständig getrocknet wird, oder wenn die vorherige Beschichtung des Deckglases mit Fibronectin (Schritte 2.1 oder 2.2) nicht effizient, die Medien-enthaltenden Zellen, die auf dem Deckglas platziert wird ihre Oberflächenspannung zu verlieren und um die erweitern Kanten des Deckglases, die Dichte der Zellen auf dem Deckglas, dadurch verringert wird. Eine Methode, dieses potentielle Problem zu beheben, ist das Medium aus dem Deck abzusaugen und dannStellen Sie das Deckglas (noch in den 35-mm-Schale) in die Rückseite des Biosicherheitsschrank für 5-10 min. Diese Anpassung kann dazu beitragen, den Luftstrom innerhalb des Gehäuses zu ermöglichen, in das Trocknen der Schüssel zu unterstützen. Wenn sichtbare Flüssigkeit auf dem Deckglas nach dem Lufttrocknen bleibt, aspirieren die Flüssigkeit Flecken und wieder an der Luft trocknen für 5-10 zusätzliche min im Biosicherheitsschrank ermöglichen. Es ist wichtig zu beachten, dass es keine Möglichkeit gibt, vollständig dieses potentielle Problem zu vermeiden, aber es ist weniger geworden ein Problem mit wiederholten Praxis des Protokolls. Es ist auch eine Fehlerbehebung Empfehlung, dass, wenn Deck für die Zellmigration Assay (oder einem Test im Allgemeinen) die Vorbereitung, extra Deck vorzubereiten und haben extra HUVECs ready-to-go im Falle von Problemen auf dem Weg.
Mit diesen Problem Überlegungen im Auge, ist es auch wichtig, den Nutzen der Protokolle zu markieren diskutiert und deren Auswirkungen in Zukunft Zellbiologie Forschung. Die Anwendbarkeit auf die polyacrylamid Ansatz ist breit gefächert und umfasst nicht nur zweidimensionale Studien der zell ECM Eingriff (oben beschrieben), sondern auch dreidimensionale Untersuchungen 5. Diese Anwendung ist entscheidend für die Erhöhung unser Verständnis, wie HUVECs Zellform und Migration in physiologischen Umgebungen zu regulieren und sollten Ermittler ein grundlegendes Verständnis dafür, wie morphologische Veränderungen koordiniert mit Zytoskelett-Veränderungen. Während die hier beschriebenen Protokolle auf Messungen der MT Wachstumsdynamik fokussiert sind, kann die Mehrzahl der Protokolle und sollte eine beliebige Anzahl von anderen mikroskopisch meßbaren Aspekte der zell ECM-Wechselwirkungen zu messen angepasst werden. Bezüglich MT Dynamik gibt es zahlreiche MAPs, einschließlich mindestens 14 Familien von kinesins 89, die jeweils mit einem potentiellen Beitrag zu einer HUVEC Polarität und gerichtete Wanderung und alle , die unter Verwendung der vorgestellten Protokolle untersucht werden können.
Zukünftige Untersuchungen sollten einelso an Engagement zell ECM im Vergleich zu Krankheitszuständen in normalen ausgerichtet sein. HUVEC Protokolle hier vorgestellten sind anwendbar auf Untersuchungen der normalen vaskulären Homöostase Prozesse sowie Krankheitszuständen, einschließlich Herzerkrankungen, Retinopathie, Tumorwachstum und Metastasierung, um nur einige zu nennen. Konjugieren sichtlich transparent ECMs und Polyacrylamid Substrate zugänglich Einhaltung Mikroskopische Untersuchungen zum Eingriff Studien zell ECM solchen Gefäßangiogenese überwacht dass endothelial Zelle mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung werden können. Diese Arten von experimentellen Ansätzen bereits offenbaren wichtige Unterschiede in endothelialen Zellform, Polarität, die Migration und die Wirkungen von Proteinen begonnen, die diese Prozesse 5,31,90 regulieren. Künftige Anstrengungen sollten zu identifizieren wollen, wie die Kombination von ECM-Compliance und Dimensionalität mechanosensing lokal Kontrollproteine dienen können, die gezielt und Zytoskeletts regulieren.
The authors have nothing to disclose.
Besonderer Dank geht an Dr. Clare M. Waterman für Mentorship und Diskussionen, Michelle Baird und Mike Davidson für die in diesen Studien verwendet, um viele der fluoreszierenden cDNA-Konstrukte bieten, und Kathryn Applegate und Gaudenz Danuser für plusTipTracker MT-Analyse-Software zu entwickeln. Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Zuschuss zu KAM von der National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) und die National Institutes of Health (NIH). (Zuschuss: 4K22HL113069).
Aurora A Inhibitor I | Selleck Chemicals | S1451 | |
2% Bis solution | Bio-Rad | 1610142 | |
3-aminopropyltrimethyloxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
40% acrylamide | Bio-Rad | 1610140 | |
405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module | Agilent Technologies | 99462 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
anti–mouse IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-1688-31 | |
anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads | TrueBlot Reagents; Rockland Inc. | 88-7788-31 | |
ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET455/50m | |
ET525/36m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET525/36m | |
ET605/70m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET605/70m | |
ET700/75m Emission Filter | Chroma Technology Corp. | ET700/75m | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | RPI Products | A30075-100.0 | |
Clara cooled charge-coupled device camera | Andor Technology | 77026010 | |
Cy3 donkey anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
Dyelight 649 goat anti-rat | Jackson ImmunoResearch | 112-496-068 | |
EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) | Lonza | CC-4143 | |
Fetal bovine serum 25 mL | |||
Bovine brain extract 2.0 mL | |||
Gentamycin sulfate 0.5 mL | |||
Epidermal growth factor 0.5 mL | |||
Hydrocortisone 0.5 mL | |||
Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL) 10.0 mL | |||
EGTA | Sigma-Aldrich | E3884-100G | |
Electronic shutter | Sutter instrument | 77016099 | |
Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
Glutaraldehyde | Thermo Fisher Scientific | S80026 | |
HALT Protease inhibitor | Thermo Fisher Scientific | PI-78425 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
HRP goat anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 115-036-062 | |
HRP goat anti-rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-036-045 | |
Immuno-Blot PVDF Membrane | Bio-Rad | 162-0174 | |
Lanolin | Thermo Fisher Scientific | 8006-54-0 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643-500G | |
Microscope | Nikon TiE | MEA53100 | |
Motorized stage | ASI Technologies | MS-2000 | |
Mounting medium | Dako | CS70330-2 | |
Mouse anti-Aurora A | Abcam | ab130156 | |
Mouse anti-GAPDH | Abcam | ab9484 | |
Mouse anti-MCAK | Abcam | ab50778 | |
Mouse anti-tubulin (DM1A) | Cell Signaling Technology | 3873S | |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
NIS Elements software | Nikon | MQS310000 | |
Nucleofector Kit V | Lonza | VACA-1003 | Contains the electroporation buffer |
Paraffin | Thermo Fisher Scientific | P31-500 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL) | MP Biomedicals | 91670249 | |
Petroleum jelly | Dow Corning | 2021854-1113 | |
Pipes | Sigma-Aldrich | P6757-100G | |
plusTipTracker | |||
Rabbit anti-GFP | Abcam | ab290 | |
Rabbit anti–pT288–Aurora A | Abcam | ab18318 | |
Rat anti–α-tubulin | AbD Serotec | MCA78G | |
Sodium borohydride | Thermo Fisher Scientific | 678-10 | |
Spinning disk | Andor Technology | Yokagawa CSU-X1 | |
Sulfo-SANPAH | Thermo Fisher Scientific | PI-22589 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34080 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | BP151-500 | |
Trypsin | Corning | MT25053CI | |
Tween-20 | Thermo Fisher Scientific | BP337 |