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生物学

Ad alta risoluzione Time-lapse imaging e analisi automatizzata dei microtubuli Dynamics in Living ombelicale umano cellule endoteliali Vena

Published: August 13, 2016
doi:
10.3791/54265
, , ,
1Department of Biological Sciences,University of the Sciences in Philadelphia

概要

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Abstract

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Introduction

L'angiogenesi è innescata da segnali extracellulari di segnalazione che promuovono le cellule endoteliali (ECS) di polarizzare, migrare con la specificità direzionale, e formare nuovi vasi nei tessuti che richiedono apporto di sangue. fattori che contribuiscono pensato di guidare angiogenesi sono segnali dalla matrice extracellulare (ECM). In risposta a stimoli fisici, EC estendere nuove filiali con specificità direzionale per guidare movimento direzionale nella formazione del 1,2 rete vascolare. L'architettura della morfologia CE e la ramificazione è definita dal regolamento localizzata del citoscheletro microtubuli (MT) in un modo che è coordinata con la regolazione del acto-miosina contrattilità 3. Al fine di rami CE per formare, miosina-II deve essere localmente downregulated, con conseguente sporgenze membrana localizzate 4. Allo stesso tempo e nella stessa posizione all'interno della cellula, dinamiche di crescita MT diventano modificati con conseguente crescita lenta e persistente MT promuovere ramo Elongazione e stabilità 5. Questo regolamento del citoscheletro coordinata permette EC di polarizzare la loro morfologia per facilitare la migrazione direzionale.

Lo sviluppo di una morfologia cellulare polarizzata richiede il montaggio polarizzata MT 6. In migrazione delle cellule epiteliali, MT crescono lentamente e persistentemente specificamente al bordo anteriore della cella 7-9; mentre nei neuroni, l'apertura e l'allungamento degli assoni o dendriti richiede che MT non solo sono presenti, ma che sono dinamicamente sottoposti ai processi di montaggio e smontaggio 10-15. In questo modo, il controllo localizzata di dinamiche di crescita MT determina l'architettura della cellula e permette una rapida rimodellamento della morfologia cellulare ECS navigare attraverso il loro ECM.

dinamiche di crescita MT sono regolati da famiglie di proteine ​​motrici molecolari e proteine ​​non motori, chiamati microtubuli proteine ​​associate o microtubuli proteine ​​interagenti (d'ora in poi refeRred come MAP). Le mappe possono essere localmente attivato o inattivato, in genere attraverso la segnalazione cascate avviate a livello di interfaccia cellula-ECM 16,17. Una volta attiva la funzione, mappe legandosi al MT e alterare la cinetica della MT montaggio e smontaggio; funzionante in tal modo di regolare a livello locale dinamiche MT al fine di promuovere la forma delle cellule e la polarità 18-20. Mitotico Centromere Associated Kinesin (MCAK) è un Kinesin-13 MAP famiglia che si lega a fini MT e coppie idrolisi dell'ATP per MT smontaggio 21-23. Questo ruolo funzionale MCAK si caratterizza per essere critici ai mitotico mandrino 24-28, così come durante l'interfase 29,30. All'interno interphase EC, MCAK mediata smontaggio MT è regolata da localizzato Aurora-A fosforilazione indotta MCAK in risposta a ferita-bordo di attivazione indotta della piccola GTPasi Rac1. Il risultato di questa cascata di segnalazione è l'inibizione della MCAK all'avanguardia di EC, con conseguente crescita MT polarizzata verso leading bordo e MCAK indotta MT smontaggio a bordo di uscita della migrazione EC 31.

metodologie tradizionali per la misurazione dinamica di crescita MT sono tipicamente utilizzati monitoraggio mano di uno tubulina fluorescenza marcata o, più recentemente, fluorescenza marcata MT Fine binding protein 1 o 3 (EB1 o EB3, rispettivamente). L'approccio tubulina fluorescente ha il vantaggio di etichettatura dell'intero array MT. Tuttavia, poiché la maggior parte dei tipi di cellule mitotiche mantenere un allineamento radiale di MTS durante l'interfase 8,32,33, MTs vicino centrosoma sono molto denso, e come risultato, il monitoraggio della crescita MT e smontaggio con la tubulina fluorescente è generalmente limitata alla periferica regioni della cellula. A causa di queste limitazioni, l'utilizzo delle proteine ​​EB fluorescenza marcata (EB1 o Eb3) è stato l'approccio più comune per misurare la dinamica MT. Perché EBs etichetta solo le crescenti più-end di MTS, appaiono come piccole (1-3 micron), fluorescenza brillante venirets, fornendo così un marcatore facilmente distinguibile di MT polimerizzazione con sfondo molto limitata fluorescenza di 34-37. Mentre il fatto che EBs etichetta solo un sottoinsieme della matrice MT rappresenta un importante forza dell'approccio EB, evidenzia anche una limitazione importante, che MTs non-maturazione non sono etichettati dall'approccio EB3. Tuttavia, la capacità di misurare e monitorare le comete Eb3 nel corso del tempo e di visualizzare la crescita MT nelle regioni sub-cellulari rendono questo approccio ideale per applicazioni che richiedono la valutazione regionale di organizzazione MT.

Un altro limite critico delle metodologie tradizionali per la misurazione dinamica di crescita mt è stata molto grandi insiemi di dati e il tempo necessario per l'analisi dei dati. Questa limitazione deriva dalla necessità di monitoraggio mano di centinaia di comete EB ad elevata risoluzione temporale. Inoltre, queste misurazioni devono essere fatte in un numero statisticamente significativo di cellule e anche effettuato sotto una varietà di controllo e experimecondizioni ntale. Recentemente, questi vincoli sono state superate attraverso tecniche di analisi computazionale specificamente dirette a comete monitoraggio Eb3 usando la microscopia time-lapse in cellule viventi 35. Se usato in modo appropriato, questo approccio computazionale serve sia per limitare il potenziale di errore umano associato mano-tracking, oltre a fornire un metodo ad elevata capacità di misurare MT polimerizzazione. Analisi computazionale della dinamica MT che utilizzano il pacchetto software MatLab-based, plusTipTracker, consente la misurazione della crescita MT di monitoraggio comete Eb3 fluorescenza marcata 5,31,35,38. Inoltre, il software plusTipTracker permette per i calcoli di eventi catastrofali MT (aka smontaggio) basati sulla scomparsa di comete Eb3 all'interno di un brano MT in crescita, e consente l'analisi sub-cellulare (aka regionale) di dinamiche di crescita MT nelle regioni definite dall'utente di interesse . Per i nostri studi, la dinamica di crescita MT sono stati confrontati all'internoregioni ramificati rispetto a regioni non ramificati, o entro leader contro bordi d'uscita delle celle. Uscita dati da software plusTipTracker può anche essere usato per generare codice colore overlay binario per le singole celle e regioni sub-cellulari.

Qui si descrive la metodologia utilizzata per studiare il ruolo di MCAK nella modulazione dinamiche di crescita MT e il contributo di questo MT depolymerase alla regolazione della CE ramificazione morfologia e la migrazione direzionale. Il nostro approccio utilizzato una linea primaria cellule umane, cellule endoteliali ombelicale Vena umana (HUVEC), che sono facilmente colto e altamente suscettibili di elettroporazione indotta, trasfezione transiente di plasmide cDNA. Abbiamo poi utilizzato ad alta risoluzione, time-lapse microscopia a fluorescenza di HUVECs trasfettate con MT Fine binding protein 3 (EB3) e Mitotic centromero Associated Kinesin (MCAK) cDNA SPECIFICI costruisce per valutare gli effetti sulle dinamiche MT transfettate HUVECs. analisi delle immagini computazionale PlusTipTracker a base di EB3MT -labeled più estremi è stato quello di misurare la velocità di crescita MT e vite di crescita MT in time-lapse immagini, per misurare e confrontare gli effetti delle manipolazioni sperimentali su dinamiche di crescita MT. Questa metodologia consente lo studio della dinamica MT e l'identificazione di come regolazione localizzata della dinamica MT nelle regioni subcellulari contribuisce ai processi angiogenici di CE ramificazione e migrazione. Queste tecniche sono applicabili alle indagini di qualsiasi mappa che può essere fluorescente ed espressi in cellule vive.

Protocol

1. HUVEC cultura e manutenzione Preparare completo medio basale endoteliale aggiungendo l'intero contenuto del endoteliali crescita cellulare pacchetto medio di integrazione e di 5% di penicillina / miscela antibiotico streptomicina al rosso fenolo Free Media basale endoteliale (vedi Materiali / lista Attrezzature per i dettagli). Warm completa medio basale endoteliale a 37 ° C in un bagno d'acqua. Rimuovere una esageratamente HUVEC dal magazzino azoto liquido e scongelare rapidamente in un bagno d'acqua a 37 ° C per 2 min. Quando ~ 80-90% scongelato, aggiungere 500 ml di terreno completo riscaldato basale endoteliale al esageratamente, mescolare pipettando, e distribuire le cellule in modo uniforme in un piatto di coltura di tessuti in plastica 100 millimetri contenente 15 ml di terreno completo riscaldato basale endoteliale. Cellule posto in un incubatore a 37 ° con 5% di CO 2. Consentono alle cellule di aderire durante la notte. Non rimuovere o modificare il terreno di coltura cellulare. Quando il piatto 100 millimetri è> 90% confluenti, trasferire i HUVECsnto di 75 cm 2 tessuto coltura trattata pallone e mantenere a> 60% di confluenza in ogni momento (vedi punto 1.5). Nota: Quando mantenuto ad una densità> 60%, HUVEC tempo di raddoppio è costantemente 18-20 ore. Per situazioni dove passaging le cellule non è necessario (cioè la densità è <90%), aspirare il terreno e sostituirlo con fresca completa medio basale endoteliale ogni 48 ore. Quando HUVECs raggiungono> 90% di confluenza, risciacquare 2 volte con 10 ml di PBS 1x, e quindi rimuovere le cellule dal piatto di coltura tissutale trattandoli 1,5 ml di 0,25% tripsina per 1-2 minuti a 37 ° C. Nota: La vitalità di HUVECs è notevolmente ridotto estendendo la durata di esposizione tripsina. cellule Rescue aggiungendo 8,5 ml completo medio basale endoteliale alla miscela / HUVEC tripsina con un rapporto di 4: 1 endoteliale basale multimediale completo: tripsina (rapporto minimo), e raccogliere in un tubo da 15 ml. Centrifugare a 1.400 g per 4 minuti. Aspirareil surnatante. Risospendere il pellet in 2 ml di completo medio basale endoteliale e aggiungere le cellule ad una nuova 225 centimetri pallone di coltura tissutale 2 contenente 25 ml di terreno di base completa endoteliale. 2. Coverslip Preparazione Prima di Cultura HUVEC Coprioggetto rivestimento con fibronectina substrati. Preparare stridulo-pulite 22 mm No. 1.5 coprioggetti 39 e conservare a temperatura ambiente (RT) in 100% di etanolo. Utilizzare un becco Bunsen a fiamma un coprioggetto e posizionarlo in una capsula di Petri 35 millimetri con una pinzetta. Preparare una miscela fibronectina / PBS mescolando 10 ml di fibronectina magazzino (1 mg / ml) con 990 ml di PBS. Dispensare 250 microlitri della miscela / PBS fibronectina sul vetrino coprioggetti nel piatto da 35 mm. Stendere uniformemente per coprire la superficie del vetrino. Incubare il piatto per un minimo di 3 ore a 37 ° C e risciacquare 3 volte con 2 ml di PBS 1x prima dell'uso. <li> Coprioggetto rivestimento con poliacrilammide (PA) Substrati. Attivazione Coverslip Posizionare un 22 millimetri No. 1.5 vetrino nel 50% a 3 aminopropyltrimethyloxysilane per 10 minuti su un piatto mescolare. Dopo l'incubazione, lavare 10 volte per 2 minuti ciascuno in bidistillata H 2 O (DDH 2 O). Incubare il vetrino in 0,5% glutaraldeide per 30 minuti su un piatto mescolare. Dopo l'incubazione, lavare 10 volte per 2 minuti in DDH 2 O. polyacrylamide Preparazione Preparare un gel PA con una compliance di 0,7 kilopascal (kPa) aggiungendo 3,75 ml di 40% acrilammide, 0,3 ml di 2% bis-acrilammide, e 0,95 ml di DDH 2 O. Preparare una soluzione di lavoro 10% di ammonio persolfato (APS) e memorizzare in ghiaccio fino al momento dell'uso. Per preparare la soluzione PA per 1 coprioggetto (volume totale = 166,7 ml), aggiungere 0,83 ml di DDH 2 O, 41,7 ml di soluzione di bis-acrilammide (effettuata al punto 2.2.2.1), 124 ml di 10% APS, e0,25 ml di TEMED. pipettare immediatamente 15 ml di soluzione di PA su un vetrino idrofobico (vedi elenco reagenti) e coprire con un attivo 22 millimetri No. 1.5 vetrino. Lasciare la PA polimerizzare per 20 minuti a RT. Rimuovere il vetrino e trasferimento in un piatto da 35 mm. Lavare 3 volte con 2 ml di PBS 1x. Conservare per <2 settimane a 4 ° c. per associare fibronectina al gel di poliacrilammide, esporre i coprioggetti poliacrilammide rivestite 2 mm solfo-sanpah con 7.500 j luce uv (254 nm). risciacquare una volta ddh o. preparare miscela > 3. cDNA Transfection e cultura HUVEC su Coverslip Completare i passaggi 1,5-1,6. Utilizzando un emocitometro, contare il numero di cellulare e raccogliere un volume contenente 100.000 cellule / coprioggetto (per esperimenti non migrazione) o 500.000 cellule / vetrino (per esperimenti di migrazione). Agglomerare le cellule tramite centrifugazione a 1.400 xg per 4 minuti. Nota: protocollo di migrazione è descritta nella sezione 9, qui di seguito. Risospendere le cellule da transfettate con 100 microlitri tampone elettroporazione. Combinate con 1 mg cDNA e riporre in elettroporazione cuvetta. Cellule elettroporazione: miscela di DNA utilizzando il programma designato per HUVEC elettroporazione (ad es programma #: A-034). Rescue cellule con 500 ml completi cellule medie e piastra basale endoteliali transfettate su un 22 millimetri No. 1.5 coprioggetto fibronectina rivestite (vedi protocollo 2.1, sopra). Incubare a 37 ° C per 3-4 ore per dare il tempo per l'espressione di costrutti di cDNA. Le "> 4. Preparazione del campione per l'imaging Tagliare il nastro biadesivo in 2,5 cm x 0,65 cm strisce. Ottenere un vetrino pulito. Prendere due strisce di nastro biadesivo e fissare orizzontalmente lungo il bordo superiore e inferiore della diapositiva. Nota: È importante permettere una piccola quantità di spazio tra il nastro e il bordo scivolo per sigillare la camera come descritto al punto 4.5). Mount coprioggetto (dal punto 3.4; cella rivolto verso il basso) tale che 2 bordi del resto coprioggetto sul nastro. Utilizzare pinze per premere delicatamente verso il basso per fissare il vetrino. Usando una micropipetta, aggiungere 40 ml di media per immagini (completo medio basale endoteliale completato con 25 mM HEPES) tra il vetrino e scivolo. Assicurarsi che lo spazio tra il vetrino e slitta è completamente riempito con il mezzo di imaging. Aspirare mezzo di imaging eccesso (se necessario). Sigillare tutti i bordi con VALAP caldo (1: 1: 1 vaselina: lanolina: paraffina). Verificare la presenza di perdite spingendo GenTLy sul vetrino di vetro. Posto montato e sigillato vetrino sul pre-riscaldato (37 ° C) palco microscopio. 5. Microscopia Utilizzando un microscopio filatura disco confocale dotato di 60X, 1,40 Apertura numerica (NA) interferenza differenziale contrasto (DIC) immersione in olio lente dell'obiettivo, un sistema di monitoraggio di messa a fuoco automatica (PFS), otturatore elettronico per illuminazione trasmessa, un X-and-Y andato in automobile fase, filtri passa banda alloggiati in una ruota filtro elettronico, e un modulo combinatore laser monolitico, si concentrano il microscopio a livello di interfaccia della cella / vetrino e utilizzare il joystick palco microscopio per individuare una singola cella. Fare clic sul pannello "Impostazioni fotocamera" nel programma software di immagine. All'interno della finestra a discesa "tempo di esposizione" del pannello delle impostazioni della fotocamera, selezionare 400 msec. Nota: I tempi di esposizione possono variare e devono essere determinati empiricamente. Fare clic sul pannello "ND Acquisition" nelsoftware di immagine del programma. All'interno della scheda lambda (λ) del pannello ND acquisizione, clicca sulle caselle di controllo per selezionare i 488 e 561 nm laser. All'interno della scheda "tempo" del pannello ND Acquisizione, impostare il tempo di acquisizione a 2 sec e il tempo totale di 2 min. Fare clic sul pulsante "Esegui ora" all'interno del pannello ND acquisizione di acquisire un time-lapse sequenza di immagini 2 min ad intervalli di 2 secondi di acquisizione utilizzando un tempo di esposizione msec 400 sia per l'illuminazione 488- e 561 nm. Nel pannello "Optical Config" del programma di software di immagine e utilizzando le impostazioni della fotocamera descritte al punto 5.2, fare clic sul pulsante del laser 405 nm e quindi fare clic su "Acquisisci" per catturare una singola immagine di proteina fluorescente blu (BFP) proteine ​​-labeled . Nota: In genere è consigliabile limitare l'esposizione delle cellule (frequenza di acquisizione di immagini e / o tempo di esposizione) per l'illuminazione laser 405 nm come questa lunghezza d'onda in grado di danneggiare le cellule nel corso del tempo. Per gli studi MCAK-shRNA, uncquire una singola immagine 405 nm per verificare l'espressione del shRNA BFP marcato. Nel pannello "Optical Config" del programma di software di immagine e utilizzando le impostazioni della fotocamera descritte al punto 5.2, fare clic sul pulsante DIC e quindi fare clic su "Acquisisci" per catturare una singola immagine DIC della cella per la ramificazione analisi della morfologia (vedere la sezione 10 , sotto). A seguito di acquisizione delle immagini, utilizzare la funzione "luminosità / contrasto" nel programma software di immagine per aumentare digitalmente il segnale di immagine. Esportare la luminosità e le immagini di contrasto aggiustato. Fai clic su "File", quindi su "Salva con nome", quindi selezionare ".tif" per il tipo di file di immagine. Nota: Questo genera tipicamente 61 .tif file di immagini da una singola 2 min acquisizione time-lapse, quando catturati come descritto al punto 5.4. 6. MT Dynamics Analysis Per il monitoraggio EB3, utilizzare il software plusTipTracker 35, un open-source,pacchetto software di calcolo MatLab-based progettato per il rilevamento automatico, il monitoraggio, l'analisi e la visualizzazione di fluorescente EBS. plusTipGetTracks Interfaccia utente grafica (GUI) Per accedere al plusTipGetTracks GUI, tipo plusTipGetTracks. Per il rilevamento EB3 cometa, utilizzare la GUI per navigare e selezionare la directory principale che contiene le immagini tif. All'interno del pannello di parametri di monitoraggio della GUI plusTipGetTracks, immettere i seguenti valori: Ricerca gamma Radius = 5 – 10; Lunghezza minima Sub-Track = 3; Max Gap Lunghezza (Frames) = 12; Max Factor restringimento = 1.0; Angolo massimo Forward = 25; Angolo massimo Backward = 10; Fluttuazione Raggio (pixel) = 2; Frame Rate (sec) = 2; Pixel Size (micron) = 110. Nota: In primo luogo controllare i parametri ottimali di monitoraggio utilizzando il plusTipParamSweepGUI su un insieme rappresentativo di .tif file di immagine. Il valore immesso per dimensione dei pixel è specifico per la lente dell'obiettivo utilizzato per acquisire l'immagine time-lapses (vedere i passi 5.1-5.2, sopra). Per regione di interesse (ROI) selezione, creare maschere binarie di tutta la cella tracciando manualmente il bordo cella utilizzando l'immagine DIC della cella per formare un poligono. Per sub-regione di interesse (sub-ROI) selezione, creare iniziali e finali maschere bordo disegnando manualmente una linea spessa 2 punti attraverso la cella ferita margini di interesse utilizzando uno strumento di selezione sub-ROI plusTipTracker modificato. Nota: La linea dovrebbe essere tracciata parallelamente al bordo della ferita nella posizione in cui la cella di interesse si estende oltre cellule vicine ferita punta 31. GUI plusTipSeeTracks Verificare e controllare visivamente le sovrapposizioni delle tracce delle immagini con estensione tif memorizzate nella cartella "ROI" facendo clic sul pulsante "Plot Tracks" nella colonna Traccia Overlay. Ripetere l'operazione per tutte le sovrapposizioni di pista. Esegui raggruppamento di dati facendo clic sul pulsante "Crea gruppi" nella colonna Impostazioni opzionali. Selezionare il sperimdati ental che appartengono allo stesso insieme di dati cliccando sui file di dati. Salvare la selezione, dando il "gruppo", un nome che può essere facilmente identificato (per esempio, "gruppo di controllo"). Per i Sub ROI-MT misurazioni dinamiche di crescita, inserire il numero minimo di fotogrammi che si EB3 cometa pista deve essere rilevato all'interno del sub-ROI al fine di qualificarsi come una "traccia" ed estrarre le escursioni di crescita MT all'interno iniziali e finali ROI bordo cliccando su "selezione manuale" all'interno del pannello "Sub-ROI" della GUI. Nota: Ad esempio, utilizzare 3 fotogrammi (6 sec) come la lunghezza minima di rilevamento da estrarre come una "pista". i brani estratti da sotto-ROI sono memorizzati all'interno di una cartella sotto-progetto all'interno della cartella ROI originale per ogni cella. la crescita MT sub-track e analisi sottopopolazione Calcolare la velocità media di crescita MT e dire MT vita di crescita per i set di dati "gruppo" (vedi punto 6.3.2), per ogni ROI (vedi step 6.2.4), e per ogni sub-ROI (vedi punto 6.2.5). All'interno della colonna di grafici a dispersione quadrante della GUI plusTipSeeTracks, clicca su "Seleziona Gruppi" e fare clic sui gruppi (creato nel passaggio 6.3.2) da confrontare. Selezionare "velocità di crescita" per l'opzione asse X e digitare il valore medio per la velocità di crescita (dal punto 6.3.4) nella casella. Selezionare "durata crescita" per l'opzione asse Y e digitare il valore medio per tutta la vita la crescita (dal punto 6.3.4) nella casella. Seleziona la casella accanto a "Rimuovere tracce a inizio / fine" e accanto a "processo batch su Gruppi." Clicca su "Make piazzole" per generare un profilo di distribuzione per MT tracce di crescita per tutta la cella, bordi d'attacco, e bordi di uscita sub-ROI. Nota: Per gli studi qui descritti, le tracce di crescita MT sono distribuiti in quattro sottopopolazioni: lenta e di breve durata, lento e longevo, veloce e di breve durata, e veloce e di lunga durata. <li> copiare i valori medi a partire dal punto 6.3.4 in un programma di foglio elettronico e salvare il file con estensione .xls. Clicca su "dati", quindi fare clic su "Analisi dei dati" dalla finestra a discesa dati. Selezionare "t-test: due campioni assumendo varianze uguali" per confrontare le velocità di crescita significa MT e vite di crescita MT. Evidenziare le celle di dati all'interno del foglio elettronico in cui i confronti t-test si traducono in un valore p <0.001. 7. Analisi Colocalizzazione Per sottrazione dello sfondo, utilizzando il "strumento a riga" del programma software di imaging, disegnare una regione di interesse (ROI) facendo clic sullo schermo per creare una forma quadrata che è di 10 micron 2 sull'immagine canale verde (488 nm di eccitazione) a una posizione in cui non vi è alcuna fluorescenza delle cellule (background). Ripetere l'operazione per l'immagine del canale rosso (561 nm di eccitazione), utilizzando le immagini dal punto 5.8. Utilizzando il software di imaging prOgram, fare clic destro sul ROI dal punto 7.1 e selezionare "Imposta come sfondo del ROI." Fare clic su "Immagine", quindi fare clic su "sfondo sottrarre" dalla finestra a discesa per sottrarre i valori di fondo medi (dal punto 7.1) dall'intero Immagine. Eseguire sottrazione del fondo per le cellule co-esprimono Em-Aurora A e sia mCherry-MCAK, Mapple-EB3, o Mapple-tubulina. Nell'immagine canale rosso sfondo sottratto solo, cliccare sulla barra multifunzione Binary e selezionare "Definisci Threshold" e quindi selezionare la funzione "per canale" per escludere il marcatore fluorescente designato. Nota: Il passo della soglia è stata eseguita su entrambi i mCherry-MCAK, Mapple-EB3, o l'immagine Mapple-tubulina per consentire le linee che hanno segnato specificamente l'oggetto thresholded per l'analisi co-localizzazione (vedi punto 7.4) disegno. Utilizzando lo strumento linea nella software di imaging, disegnare una linea spessa 2 punti negli oggetti esclusi all'interno dell'immagine thresholded. Selezionare gli oggetti linea tracciata al punto 7.4. Copiare e incollare gli oggetti della linea del canale rosso sulla sua immagine corrispondente canale verde (Em-Aurora A). Misurare i valori di intensità dei pixel in scala di grigi sotto la linea di oggetti per calcolare i valori totali Em-Aurora-A co-localizzazione e per ogni singola cella selezionando "Measure", quindi "Intensity Profilo" dalla finestra a discesa all'interno del programma software di imaging. Organizzare i dati per il trattamento sperimentale e regione sub-cellulare per l'esportazione in un programma software foglio di calcolo e salvare il file come tipo .xls (ad esempio, "control_grayscale_intensity.xls"). Nota: I dati presentati in questo modo rappresenta la frazione di co-localizzazione del totale misurato Em-Aurora-A per regione sub-cellulare. Usando i valori misurati dal punto 7.6, ripetere il punto 6.3.7 per calcolare la significatività statistica con p <0.05 come cutoff per importanza. <pclass > 8. immunofluorescenza Fissare le cellule (vedi punto 3.4) con paraformaldeide / glutaraldeide co-estrazione / tampone di fissaggio (PGF-PHEM; paraformaldeide al 4%, 0,15% glutaraldeide, 0,2% di detergente in 60 TUBI mm 27,3 mM HEPES, 10 mM EGTA, e 8,2 mm MgSO 4, pH 7,0) per 10 minuti a RT. Lavare 3 volte per 5 minuti con 2 ml di PBS 1x. Trattare 2 volte per 15 minuti con 0,01 g / ml NaBH 4 in PBS 1x per placare aldeidi reattive. Nota: NaBH 4 forme bolle che possono causare i coprioggetti di galleggiare. E 'fondamentale che i coprioggetti rimangono sommerse durante questi incubazione. Se i coprioggetti iniziano a galleggiare, utilizzare pinze per elevare un bordo del vetrino per permettere le bolle di fuoriuscire. Lavare 2 volte con PBS 1x prima di bloccare con 5% di latte senza grassi in 1x PBS su una piattaforma oscillante per 1 ora a RT. Incubare le cellule in anticorpi primari (coniglio anti-pT288-Aurora A (1: 1.000)) e nel ratto anti-α-tubulina (1: 500) preparato in soluzione PBS 1x. Incubare a 4 ° C durante la notte su una piattaforma oscillante. Rimuovere gli anticorpi primari e risciacquare 3 volte per 5 min in PBS 1x prima di incubazione con anticorpi secondari (asino anti-coniglio (1: 1.000) e di capra anti-topo (1: 1.000)) preparato in senza grassi del latte del 5% per 2 ore a 37 ° C. vetrino monte su un vetrino in mezzo di montaggio a fluorescenza ottimizzato. Sigillare i bordi coprioggetto alla diapositiva con smalto trasparente, e conservare al buio a 4 ° C. 9. cellulare Migration Assay Eseguire la cultura HUVEC per le prove di migrazione come descritto in precedenza (protocollo 3: cDNA Transfection e cultura HUVEC su Coverslip, a pochi passi 3.2-3.3). A seguito di trasfezione delle cellule, le cellule di soccorso trasfettate con 80 microlitri completo medio basale endoteliale. Pipettare il campione 80 microlitri come una goccia sul centro di un 22-mm tondo No. 1.5 coprioggetto fibronectina rivestite essiccato. Non diffondere la dro 80 microlitrip. Incubare a 37 ° C per 3-4 ore per dare il tempo per l'adesione cellulare in un monostrato confluente. Nota: Asciugatura del vetrino è necessario per evitare la caduta di 80 microlitri di diffondersi al contatto del vetrino. Questo approccio consente di HUVEC per essere concentrate in una piccola area del vetrino e favorisce quindi la rapida formazione di un monostrato confluente di cellule. Lavare 2 volte in totale medio basale endoteliale per rimuovere le cellule non-collegati. Per creare un "bordo della ferita," raschiare il vetrino con una lama di rasoio sterilizzato trascinando delicatamente una lama di rasoio pulito attraverso il monostrato HUVEC (dal punto 9.2). Tenere il vetrino delicatamente sul posto con una pinza per evitare lo slittamento della lama di rasoio durante la raschiatura. Permettono alle cellule di recuperare in un incubatore a 37 ° per 3 ore. Assemblare e montare vetrino (s) per l'imaging (vedi protocollo 4). Acquisire a contrasto di fase e le immagini di 488 nm a intervalli di 10 min per 12 ore sul microscopio con un10x 0,45 NA fase obiettivo e un NA LWD condensatore 0.52 utilizzando il pannello "ND Acquisizione" del programma software di acquisizione immagini (descritto al punto 5.3). 10. La quantificazione di HUVEC Branching e migrazione Per ramificazione analisi e per consentire un'illuminazione uniforme delle cellule e la quantificazione imparziale, acquisire un'immagine microscopica di un HUVEC trasfettate (vedi punto 3.3) ed esprimendo il Mapple-C1 cDNA costruire, un marker volume cellulare. Utilizzando il programma software di imaging, aprire l'immagine Mapple-C1 ed etichetta la posizione su entrambi i lati del ramo in cui la membrana mostra la maggiore dell'angolo di curvatura. Collegare questi due punti con una linea retta. Questa linea è l ' "origine ramo." Utilizzando lo strumento linea del software di imaging, identificare visivamente i rami che misurano> 10 micron di lunghezza dal "origine ramo" determinato al punto 10.2. Calcolare la lunghezza ramo misurando la distanza da the "origine ramo" al punto più distale della punta ramo (vedere la Figura 4). Contare il numero di sporgenze ramificati che misurano> 10 micron di lunghezza per ottenere "numero della filiale di cellule." Per l'analisi di migrazione, utilizzando le immagini raccolte nel passo 9.6, identificare visivamente un HUVEC ferita bordo in base alla posizione fisica (cioè le cellule fisicamente ai margini della ferita) e profilo di espressione (ad esempio, selezionare una cella bordo ferita verde se l'esperimento comporta espressione di GFP). Utilizzando le immagini a contrasto di fase della cella, identificare visivamente il nucleo (struttura sferica semitrasparente vicino al centro della cellula), e quindi identificare visivamente il nucleolo (un piccolo, di colore scuro, struttura sferica all'interno del nucleo) a il primo punto tempo delle immagini time-lapse. Fare clic sulla posizione del nucleolo di etichettare le coordinate X e Y del nucleolo. Utilizzando il software di imaging, mano-tenere traccia delnucleolus in time-lapse immagini successive cliccando sulla posizione del nucleolo di etichettare le coordinate X e Y del nucleolo in ogni fotogramma del filmato time-lapse (Figura 4). Utilizzando il software di imaging, fare clic su "File" e poi cliccare su Salva con nome ", quindi fare clic per selezionare il tipo di file di immagine" .xls ". Aprire il file di dati a mano inseguimento (dal punto 10.8) utilizzando un programma di fogli di calcolo. Calcolare la velocità di migrazione media e media distanza di migrazione di origine. Utilizzando un programma di fogli di calcolo, clicca su "dati", quindi clicca su "Analisi dei dati" dalla finestra a discesa dati. Selezionare Bonferroni-corretto, l'analisi a senso unico dei test di varianza con> 95% come soglia di significatività statistica.

Representative Results

cultura HUVEC per microscopia live-cell Live-cell imaging di HUVEC esprimono proteine ​​fluorescenti richiede che HUVEC sono mantenuti in un ambiente che è adatto per la normale crescita cellulare e la manutenzione, nonché espressione della proteina normale e funzione. La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica del protocollo utilizzato per preparare una tamponata e sistema chiuso che mantiene ottimizzato caratteristiche ottiche per la raccolta di immagini time-lapse di cellule vive. Sottili strisce di nastro biadesivo sono posti su un vetrino (Figura 1A) e poi il vetrino contenente la coltura HUVECs è invertita sopra del nastro in modo tale che le cellule siano rivolti vetrino (Figura 1B). In questo modo, il nastro fornisce un piccolo spazio tra le due superfici di vetro, e crea uno spazio in cui le cellule possono essere bagnati in appositi mezzi di coltura cellulare (Figura 1C; vedi protocollo 4, sopra). iona passo finale, il vetrino di vetro è sigillato al vetrino con una vaselina: paraffina: lanolina (1: 1: 1 miscela, VALAP; Figura 1D) per stabilire un sistema chiuso. Questo approccio coltura cellulare è stato utilizzato sia per imaging breve sequenza temporale di comete Eb3 e per la sequenza di tempo maggiore ramificazione e esperimenti di migrazione. Inoltre, la consistenza simile alla cera di VALAP consente una facile rimozione dal vetrino e coprioggetto alla fine di un sistema di imaging sperimentare tale che approcci supplementari inclusi fissazione e immunolabelling (vedi protocollo 8), può essere effettuata sullo stesso vetrino e campione cellulare che è stato visualizzato utilizzando l'approccio live-cell imaging. Figura 1:. Metodologia della cultura HUVEC per il live-cell immagini microscopiche (A) Tagliare 2 pezzi di nastro biadesivo in 0,65 cm x 2.50 cm strisce rettangolari e garantire un pezzo di nastro biadesivo orizzontalmente lungo il bordo superiore della diapositiva e l'altro pezzo, lungo il bordo inferiore della diapositiva. È importante consentire una piccola quantità di spazio tra il nastro e il bordo scivolo per sigillare la camera come descritto in (D). (B) Utilizzando pinze rimuovere il vetrino contenente HUVECs e invertono il vetrino (lato della cella verso il basso) sulla parte superiore dei pezzi di nastro. (C) Usando una micropipetta, aggiungere 40 ml di mezzi di imaging (terreno completo basale endoteliale addizionato con 25 mM HEPES) tra il vetrino e il vetrino. Assicurarsi che lo spazio tra il vetrino e slitta è completamente riempito con i media di imaging e di evitare bolle. Utilizzare un aspiratore lungo il bordo del vetrino per rimuovere l'eccesso supporto, se necessario. (D) Usare VALAP caldo (1: 1: 1 di vaselina: lanolina: paraffina) per sigillare intorno ai bordi del vetrino. Verificare la presenza di perdite di supporti di imagings spingendo intorno delicatamente sul vetrino. Utilizzare ulteriore VALAP per rimediare. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura. automatizzato di monitoraggio di EB3 fluorescenza marcata consente un'analisi completa di tutto il cellulare e dinamiche di crescita MT regionali. La raccolta di immagini microscopiche chiare, distinte, e molto tempo e spazio risolta della proteina EB3 è essenziale per l'analisi dei movimenti Eb3 all'interno della cellula. HUVEC espressione di EB3 fluorescenza marcata varia ampiamente da cellula a cellula e l'intensità di fluorescenza aumenta tipicamente all'interno della stessa cella durante un periodo di ore. Pertanto, è importante considerare e monitorare questi cambiamenti nel profilo di espressione per identificare potenziali effetti di aumento di espressione EB sulle dinamiche di crescita MT. Questo è meglio raggiunto attraverso la valutazione a scala di grigi a fluorescenza intesitàprofili y per ogni cella ripreso e quindi limitando l'analisi dei dati di quelle cellule che presentano un intervallo definito di profili di espressione in scala di grigi. Valutazione iniziale di set di dati profilo di espressione è critica e deve essere confrontato con MT dati dinamiche di crescita che si ottiene dal software plusTipTracker per ogni cella. profili di espressione possono essere rilevate in velocità di crescita MT e MT durata crescita per ogni cella all'interno di un gruppo sperimentale, per determinare l'intervallo desiderato di espressione scala di grigi e per identificare potenziali valori anomali. La figura 2 evidenzia una HUVEC coltivate su un substrato di fibronectina (vedi protocollo 2.1, sopra) e che esprimono nei pressi di livelli ottimali di EB3 Mapple marcato. Comete Eb3 fluorescenti sono mostrati in una serie temporale-lapse di immagini su un periodo di 12 sec (Figura 2A). Analisi delle comete Eb3 utilizzando il software plusTipTracker comporta un automatico, fotogramma per fotogramma EB3 cometa detection (punti verdi e gialli, Figura 2b). Le comete rilevati all'interno di ciascun frame vengono quindi collegati, dipende dalla loro cambiamento di posizione da fotogramma a fotogramma, per generare tracce Eb3 e una sovrapposizione pista EB3 visivo (Figura 2C-F). sovrapposizioni pista sono codificati a colori e le distinzioni di colori possono essere determinati da parametri inseriti dall'utente. Comunemente, queste distinzioni utilizzano la media globale della velocità di crescita MT e MT crescita durata 5,31 e quindi suddividere i dati in quattro gruppi: lenta e di breve durata (rosso), lento e longevi (giallo), veloce e breve vissuto (verde), e la crescita MT veloce e di lunga durata (blu; Figura 2G). monitoraggio PlusTipTracker-mediata di dinamiche di crescita MT Eb3 marcato consente inoltre Regioni definite dall'utente di interesse (ROI). PlusTipTracker estrae i dati della traccia crescita MT all'interno della ROI definito dall'utente (Figura 2A, B e F), consentendo in tal modo per il confronto di MT crescita dynamics all'interno di diverse regioni della stessa cella. Figura 2: rilevamento cometa EB3, il monitoraggio, e l'uscita dei dati plusTipTracker (A) filmato time-lapse di un HUVEC esprimere Mapple EB3.. pannello di sinistra mostra una vista cellula intera e la maschera cellula intera (linea bianca) demarking i bordi delle celle. Casella rossa rappresenta la regione ingrandita mostrato nelle immagini time-lapse (pannelli a destra). pannelli di destra mostrano time-lapse immagini in scala di grigi prime di comete Eb3 in cornici per immagini successive (t = 0 sec – t = 12 sec). (B) la rilevazione plusTipTracker delle comete Eb3 dalle immagini mostrate in (A). pannello di sinistra mostra una vista di cella intera comete rilevati (punti gialli). Casella rossa rappresenta la regione ingrandita mostrato nelle immagini time-lapse (pannelli a destra). pannelli di destra evidenziano cinque comete Eb3 rilevati (frecce rosse) e ripercorrono quei cinque comete nel periodo di imaging 12 sec. verde puntini rappresentano rilevati comete Eb3 che non esistevano (o non sono stati rilevati) nel precedente intervallo di tempo. (C) di proiezione massima intensità di 61 frame (2 min film) delle comete Eb3 mostrati in (A). (D) plusTipTracker MT traccia overlay degli stessi 61 fotogrammi (2 min film) indicati in (C). (E) Zoom di proiezione massima intensità (box rosso in C). (F) Zoom di plusTipTracker MT traccia overlay di proiezione massima intensità (box rosso in D). Leggenda per le sovrapposizioni di pista mostrate in (D) e (F) (G) con codice colore. Designazione come lento, veloce, di breve durata o di lunga durata si basa sul valore medio per tutte le tracce di crescita misurati in un gruppo di dieci Mapple-Eb3 HUVECs che esprimono. Per facilitare la visualizzazione, sovrapposizioni di pista a (D) e (F) sono generati utilizzando intensità dei pixel invertiti dell'immagine cellule mostrato in (A). Barre di scala = 20 micron./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. HUVEC ramificazione e modelli di migrazione sono sensibili al meccano-fisiche segnali dalla ECM. HUVECs sono ben noti a rispondere a vari tipi di segnali di segnalazione e, in tal modo, a subire alterazioni morfologiche che dettano una risposta cellulare adeguata al particolare spunto di segnalazione (s) 36,40-42. HUVECs coltivati ​​su substrati di vetro rivestito fibronectina (Figura 3a), o su rigide ECM poliacrilammide 2 dimensioni (55 kPa) tipicamente visualizzare un giro o morfologia allungata con poche sporgenze ramificate distinti (Figura 3B). Tuttavia, quando coltivate su molto morbidi ECM poliacrilammide 2-dimensionali (0,7 kPa), HUVECs visualizzare una morfologia molto ramificata che è noto per il risultato di conformità indotta verso il bassoregolazione della miosina-II contrattilità 4,5,31 (Figura 3C). Così, HUVECs regolano la loro morfologia cellulare attraverso ECM mechanosensing, e questo si realizza attraverso la modulazione localizzata di dinamiche MT e acto-miosina contrattilità. Poiché HUVECs visualizzare un'ampia varietà di attributi morfologici, al fine di misurare HUVEC ramificazione è importante definire prima cosa una sporgenza ramificato è, quindi per definire come una sporgenza ramificato sarà misurato oggettivamente. Una tecnica utilizza un approccio in quattro fasi con cui un limite di cella o "maschera" viene generato a mano tracciando i bordi della cella utilizzando un'immagine di una cellula che esprime un marcatore fluorescente del volume per definire i bordi delle celle (Figura 3D). Dopo generazione maschera, origini filiali sono definiti localizzando grande angolo di curvatura tra la protrusione ramificato e il corpo cellulare. Una linea è disegnata per Demark "origine ramo" (linee angolate viola; Figura 3E). Numero Branch è misurata semplicemente contando il numero di sportelli, con un ramo di origine definita (Figura 3F). Lunghezza Branch è misurata come la distanza dall'origine ramo punta ramo distale (Figura 3G). Per evitare l'inserimento di piccole proiezioni lamellipodial da analisi dei dati, criterio che si aggiunge richiede che i rami devono essere più lunghi ( "lunghezza ramo") che larghi (presso l ' "origine ramo"), e che i rami devono essere almeno dieci micron di lunghezza 5 , 31. . Figura 3: Analisi di HUVEC ramificazione morfologia (A – C) esempi di immagini DIC di HUVECs coltivati ​​su rivestito fibronectina ECM di vetro (A) rigide (55 kPa) ECM poliacrilammide (B) e soft (0,7kPa) ECM poliacrilammide (C). Ramificazione è drammaticamente aumentato negli HUVECs coltivati ​​su 0,7 kPa ECM poliacrilammide (C) rispetto ai più rigidi ECM (A, B). (D). DIC immagine microscopica (immagine a sinistra) di un HUVEC trasfettate che esprimono un Mapple-C1 cDNA costruire (un marcatore volume cellulare; immagine a destra). (E) Definire l'origine ramo individuando il massimo angolo di curvatura (cioè la posizione in cui la membrana visualizza la massima curvatura; linee color porpora) su entrambi i lati del ramo e quindi collegare gli angoli con una linea retta (linee blu) . (F) individuare e selezionare sporgenze ramificati che si estendono> 10 micron dal "origine ramo" (definito in E). Contare il numero di sporgenze ramificati per ottenere il "numero della filiale". (G) Misurare la distanza dal centro del "origine ramo" al most punto distale del ramo con lo strumento linea nella annotazioni e misurazioni applicazione di NIS elementi software per ottenere la "lunghezza ramo." Barre di scala = 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Oltre al rispetto ECM sensing, HUVECs anche senso e rispondere all'eliminazione dei contatti cellulari adiacenti indotta da zero ferimento. Nel saggio di migrazione, HUVECs coltivate in monostrato sono sottoposti ad una ferita zero e caratteristiche di migrazione sono misurati (vedi protocollo 9, sopra). Dopo l'induzione della ferita grattando il monostrato, HUVECs ferita-bordo polarizzano sviluppando un bordo anteriore sporgente che si estende nella ferita (Figura 4A, t = 0 ore). Nel corso di un corso di tempo di 10-12 ore, polarizzati HUVECs ferita-edge migrano nella zona della ferita e riempire ilferita, stabilendo un nuovo monostrato confluente (Figura 4A, t = 11 ore). Come con HUVEC ramificazione, attuale evidenza suggerisce che la polarizzazione e la migrazione è critico dipende dalla coordinata riorganizzazione del citoscheletro di actina e MT 43-49. Questo risultato è ottenuto, in parte, attraverso l'inibizione localizzata di MCAK indotta MT smontaggio all'avanguardia, ma non al bordo posteriore della ferita bordo HUVECs 31. La sensibilità della dinamica MT per ferita indotta polarizzazione viene avviata dal Rac1 GTPasi, che si rivolge numerose proteine ​​regolatore a valle, tra cui Aurora-A-chinasi che fosforila e inibisce MCAK all'avanguardia, e altre chinasi che sono in grado di inibire o attivando MAP localmente modulare la crescita MT e ritiro 18,31,36,48,50-53. Ampie prove sperimentali supporta la nozione che il coordinamento dei leader protrusione bordo di entrata e di uscita contrazione bordo è regolato attraverso cicli di attivazione di Rac1promuovere MT assemblaggio all'avanguardia e l'attivazione RhoA a acto-miosina contrattilità al bordo di uscita, in modo da guidare la motilità diretto 9,41,51,52,54-58. Ad oggi, non c'è una metodologia stabilita per eseguire il monitoraggio automatico della migrazione cellulare. Questo è il risultato di difficoltà di analisi computazionalmente confini cellula-ECM che sono costantemente cambiando come cellule ferita punta polarizzano e migrano. Mentre molti programmi software sono in grado di tracciare cellule fluorescente 59-64, la popolazione di fluorescente HUVECs in esperimenti di migrazione ferita punta è circa il 30-40% della popolazione totale HUVEC, e quindi la maggior parte delle cellule ferita tagliente può essere visualizzati da contrasto di fase o l'imaging DIC. Inoltre, è importante quando si misura la migrazione ferita bordo per valutare le cellule fluorescenti e non fluorescenti all'interno della stessa ferita per individuare specificoeffetti di espressione crea sia all'interno di gruppi di studio sperimentali e tra i gruppi di studio sperimentali. Attualmente, il metodo migliore per misurare la migrazione HUVEC è di utilizzare un approccio inseguimento mano in cui una cella ferita bordo è identificato e poi il nucleo e nucleolo sono identificati (Figura 4B). Il nucleolo viene usata come posizione determinante per il monitoraggio delle cellule causa della sua densità dispersione luce alta e relativamente piccole dimensioni. Queste due caratteristiche del nucleolo rendono più facile identificare e ridurre errori di misurazione limitando l'area in cui l'utente può inserire singole posizioni di traccia. tracce di migrazione HUVEC sono poi generati cliccando sul nucleolo in successive fotogrammi di immagini time-lapse. Infine, velocità di migrazione e distanza di migrazione all'origine sono misurati ed analizzati per il controllo e gruppi di cellule sperimentali (Figura 4B). <img alt="Figura 4"src = "/ files / ftp_upload / 54265 / 54265fig4.jpg" /> Figura 4: Analisi di HUVECs ferita-edge e il monitoraggio della migrazione immagini (A) 20X a contrasto di fase di un time-lapse serie di imaging 11 ore di zero ferita bordo HUVECs (alias "Migration Assay").. La ferita e la direzione della migrazione sono indicati in pannello t = 0 hr. HUVEC sono presenti per attraversare la ferita bordo e avanzare nella ferita fino a formare un monostrato di cellule (t = 3,5 hr – t = 11 h). (B) Analisi del dosaggio migrazione dell'imaging time lapse (come indicato in A) richiede innanzitutto l'identificazione di un tracciabili HUVEC ferita bordo in base alla posizione delle cellule (cioè le cellule fisicamente ai margini della ferita) e profilo di espressione (i .e. , selezionare una cella bordo della ferita verde se l'esperimento comporta espressione di GFP). Usando l'immagine a contrasto di fase, identificare il nucleo e il nucleolo. Mano traccia nucleolo in time-lapse immagini successive utilizzando l'unanotazioni e misurazioni applicazione nel software NIS elementi per determinare la velocità di migrazione e la distanza alla loro origine. Scala bar = 100 micron (A), 20 micron (B). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Utilizzando HUVECs nella morfologia e migrazione esperimenti.
live-cell imaging di dinamiche di crescita MT Eb3 marcato all'interno HUVECs richiede condizioni di coltura delle cellule appropriate e riproducibili, al fine di misurare e valutare i cambiamenti nella crescita MT e HUVEC morfologia, tali da poter poi essere assegnati a uno spunto di segnalazione ECM. HUVECs rappresentano un ottimo modello per studiare la forma delle cellule e la motilità. Essi sono altamente suscettibili di trasfezione con cDNA fluorescenza marcata, essi mostrano morfologie drammatiche in risposta ad entrambi i segnali di segnalazione solubili e fisiche, e mantengono la capacità di organizzarsi in tubi vascolari quando fornito appropriate condizioni di coltura delle cellule 65-70. colture cellulari primarie, come HUVECs, richiedono attenta gestione e il monitoraggio del numero di passaggio di cellule al fine di garantire le cellule sono in buona salute e che si comporteranno normalmente durante la sperimentazione. Ad esempio, quando condurre esperimenti che indagano sul cytoskeleton e / o morfologia delle cellule, HUVECs non devono essere utilizzati per gli esperimenti oltre il decimo passaggio coltura cellulare, come HUVECs tipicamente iniziano a visualizzare morfologie non uniformi in tutto il passaggio dodici a quindici.

densità delle cellule è anche un regolatore di salute critiche HUVEC e la proliferazione. HUVEC indagini ramificazione (vedi protocollo 10,1-10,4, sopra) utilizzano colture relativamente bassa densità cellulare in modo da fornire le cellule spazio fisico di interagire con l'ECM ed estendere sporgenze ramificate. Al contrario, negli studi di migrazione ferita-edge (vedi protocollo 10,5-10,8), HUVECs sono cultura in un monostrato prima di ferimento. Come tale, HUVECs ferita-bordo mostrano una morfologia relativamente non-ramificato, estendere leader sporgenze bordo, ed esibire interazioni cellula-cellula con i loro vicini immediati quando migrano nella ferita.

Avvertimenti e vantaggi di monitoraggio MT Dynamics in Living HUVECs.
Spinning microscopia disco è un ottimo approccio perverificare ipotesi sperimentali che richiedono chiarezza di immagine confocale ad alta risoluzione temporale. Con il modulo telecamera e laser caso, questo approccio la microscopia è sensibile alle basse emissioni e di fluorescenza può aiutare a ridurre photobleaching rispetto ad altri tipi di microscopia a fluorescenza. È importante sottolineare che questo approccio è anche adatto per moderata a imaging ad alta risoluzione temporale come è richiesto per generare misurazioni complete della dinamica di crescita MT utilizzando l'approccio di etichettatura EB3, in una varietà di tipi cellulari.

Mentre la metodologia EB3 di etichettatura crescente MT plus-estremità presenta evidenti vantaggi rispetto ad altri metodi di etichettatura fluorescente MT, ha anche degli svantaggi unici. Ad esempio, vi è una percentuale della matrice MT che non cresce attivamente in un dato momento, comprendente sia la popolazione di MTS smontaggio e la popolazione di stabili, MTS non dinamici 71-74. EB3 non etichettare queste due popolazioni di MTS equindi il contributo di queste due popolazioni non sarebbe incluso nell'analisi dei dati sperimentali. metodologie alternative per la valutazione l'intero array MT si sono concentrati sulla espressione di tubulina fluorescenza marcata, che incorpora in tutte le popolazioni di MTS e consente l'identificazione di crescere, restringimento e stabile MTS. Tuttavia, a causa della relativamente alta densità della matrice MT vicino al centro della cella e adiacente al microtubulo organizzare centrale (MTOC), etichettare l'intero array MT crea uno svantaggio per eseguire l'analisi di immagine di estremità MT che non sono vicino alla cella periferia 75-77. Gli esperimenti che utilizzano due colori di co-etichettatura di MTS con tubulina fluorescenti e EB3 fluorescente in cellule vive hanno rivelato, qualitativamente, che la stragrande maggioranza di MTS tubulina marcato sono anche EB3 marcato 78. Inoltre, non vi è stato un metodo efficiente di inseguimento automatico di MTS etichettati con tubulina fluorescente. Ciò significa che i dati Raccoltezione e le misure di dinamica MT in cellule che esprimono tubulina fluorescenti richiedono monitoraggio mano di singoli MT, un processo che è soggetto a errori e noioso. Di conseguenza, l'analisi automatizzata computazionale di Eb3 marcato MTS è diventato il metodo preferito per la misura dinamica MT quanto può essere applicato a MT dinamica esperimenti in numerosi tipi di cellule e all'interno di una varietà di regimi sperimentali 35,79.

Collegamento MT dinamiche di crescita di HUVEC Morfologia e migrazione.
Dal punto di vista di un investigatore del citoscheletro, un adattamento estremamente utile del plusTipTracker automatizzato di analisi di monitoraggio è la capacità di misurare e valutare entrambe le alterazioni cellulari e regionali interi nelle dinamiche di crescita MT. Il requisito per una cella di diventare polarizzata è un pre-requisito essenziale per la migrazione delle cellule direzionale. Come tale, stecche di segnalazione polarizzati sono da tempo noti come fattori di guida fondamentali per la migrazione delle cellule direzionale 30,31,51,54,56,80,81 </sup>. Ad esempio, molecole di segnalazione solubili, come il VEGF induce polimerizzazione e la crescita MT verso lo spunto VEGF in tipi di cellule endoteliali 2,82-87. Inoltre, in risposta alle interazioni fisiche con l'ECM (per esempio, il rispetto e la dimensionalità mechanosensing), HUVECs modulano le loro dinamiche MT dal livello locale regolando Maps per promuovere la crescita MT all'interno allungamento sporgenze ramificati, e questo serve a guidare la migrazione HUVEC nella direzione della spunto 5,31,88. Così, la polarizzazione in risposta a segnali di segnalazione extracellulari mette in evidenza la necessità di una valutazione sperimentale delle variazioni localizzate nelle dinamiche del citoscheletro.

live-cell imaging simultaneo della dinamica MT crescita (utilizzando l'approccio EB3) e la migrazione delle cellule HUVEC è estremamente difficile da eseguire a causa MT crescono su una scala temporale di secondi, mentre le variazioni nella morfologia cellulare e la migrazione direzionale si verificano su una scala temporale di ore. Eppure entrambi i processi sono intimamente linked. Inoltre, continua, rapida imaging EB3 fluorescenza marcata sulla seconda scala temporale conduce photobleaching del segnale EB3. Tentativi di superare questo problema conducendo breve serie di immagini di EB3 (serie acquisizione 1-2 min) ogni 30 minuti hanno avuto successo, ma potrebbe essere realizzato solo in un piccolo numero di cellule endoteliali che aveva l'espressione ottimale di EB3 e che non visualizzava negativo effetti alle illuminazione laser ripetuto 5.

Un approccio alternativo che permette di interpretazioni di come le dinamiche di crescita MT contribuiscono ai cambiamenti nella morfologia cellulare e la migrazione è la Regione plusTipTracker di interesse (ROI) strumento 35 (vedi protocollo 6.6). Questa metodologia permette di tutta la crescita delle cellule MT tracce per essere suddivisa in regioni definite dall'utente, da cui le tracce di crescita MT possono essere estratti e analizzati. Ad esempio, i confronti di "ramificata" contro "non ramificati" regioni della cellula hanno rivelato che MT crescono più sumile e più persistente all'interno delle regioni ramificati rispetto alla non-ramificato periferia cellulare 5. In polarizzata ferita-edge HUVECs, confronti dei principali bordo e finali dinamiche di crescita bordo MT rivelato che MCAK indotta MT smontaggio è inibita in particolare all'interno del bordo d'attacco, ma non il bordo d'uscita. la valutazione regionale di iniziali e finali dinamiche di crescita bordo MT in HUVECs esprimono Rac1 e / o mutanti di fosforilazione di MCAK inoltre rivelato che l'attivazione Rac1-indotta di Aurora-A-chinasi specifica e localmente inibisce l'attività MCAK all'interno del bordo d'attacco di guidare HUVEC polarizzazione e la migrazione direzionale 31. Pertanto, la combinazione di automatizzato di monitoraggio delle dinamiche di crescita MT e la valutazione regionale della dinamica di crescita MT all'interno delle sporgenze ramificati e / o il bordo della ferita-edge HUVECs ci ha permesso di collegare dinamiche di crescita MT a HUVEC morfologia e la migrazione.

I protocolli descritti sono designed per fornire una metodologia di solito, semplice e altamente ripetibile per la cultura HUVEC e indagine sperimentale. Tuttavia, molti dei dettagli del protocollo sono complesse e richiedono tempo, che, a sua volta, fornisce possibilità di errori o difficoltà nella conduzione della metodologia sperimentale. Mentre si è cercato di affrontare i problemi potenziali in tutto il protocollo, qui viene fornito ulteriori, la risoluzione dei problemi dettagliata dei potenziali problemi che sono meno comuni o in altro modo abbreviato come note all'interno dei protocolli di metodologia.

Relativi a lamelle di rivestimento con i substrati di poliacrilammide (protocollo 2.2), un problema comune che si pone è la natura complessa di attivare vetrino, accoppiando poliacrilammide al vetro, attivando poliacrilammide, e quindi l'accoppiamento ECM alla poliacrilammide. Uno particolarmente difficile e potenzialmente problematico passo è la coltura HUVECs sul gel fibronectina / poliacrilammide in seguito all'esposizione del Polyacoprioggetto crylamide rivestite a 2 mm solfo-SANPAH (step 2.2.2.6, sopra). E 'fondamentale per il successo della coltura HUVECs su questi substrati che solfo-SANPAH essere completamente rimosso dal sistema sperimentale seguente ECM coniugazione. Questo può essere meglio raggiunto mediante lavaggio con DDH 2 O e incubando i coprioggetti in DDH 2 O su un agitatore durante la notte. Se le cellule in coltura sulle ECM poliacrilammide non sopravvivono, o se la vitalità è inferiore al previsto, è aumentata e ha ripetuto il lavaggio di solfo-SANPAH dopo coniugazione di fibronectina (passo 2.2.2.9) si raccomanda di potenzialmente alleviare questo problema.

Correlate al protocollo 3 (cDNA trasfezione e cultura HUVEC su un vetrino), una grande influenza per il successo della procedura di elettroporazione è la gestione delle HUVEC sia durante tripsinizzazione delle cellule per rimuoverli dal recipiente di plastica, e dopo la conclusione di l'elettroporazione (passi 3.3-3.4, sopra). E 'fondamentale per la curapienamente monitorare il HUVECs mentre in tripsina, e non superare il tempo necessario per le celle a "round-up" sulla superficie del pallone (tipicamente 1-2 min). tempo eccessivo in tripsina è una delle principali cause di HUVEC morte, che non è in genere realizzato fino a quando le cellule sono placcati su vetrini fibronectina rivestite (punto 3.4) e quindi non riescono a collegare al substrato.

Altrettanto importante, HUVECs (e la maggior parte dei tipi di cellule primarie) non se la passano bene quando sospeso per lunghi tempi nel buffer elettroporazione. Durante gli esperimenti larga scala, per esempio, in cui l'utente ha cinque o più condizioni che richiedono elettroporazione, è meglio mantenere le cellule pellet in singoli tubi (1 tubo per trasfezione) e mescolarli, one-at-a-time , nel buffer elettroporazione immediatamente prima elettroporazione. Questo approccio riduce al minimo il tempo di incubazione in tampone elettroporazione e massimizzare la sopravvivenza HUVEC. Inoltre, il salvataggio immediato in terreni di coltura completo è anche critical dopo l'elettroporazione. ritardi di salvataggio di un minuto o più dopo l'elettroporazione può provocare vicino alla morte completa HUVEC e, quindi, dovrebbe essere evitato.

Correlate assay migrazione cellulare (protocollo 9), la tecnica di coltura HUVECs ad altissima densità dipende da una modifica critica (descritto nel passaggio 9.2) della metodologia coltura cellulare tradizionale HUVEC (descritto nel protocollo 3) che richiede essiccazione della rivestito fibronectina coprioggetto al fine di consentire la cultura HUVEC in un'area molto piccola del coprioggetto. Spesso, se il vetrino non è completamente asciugato o se la prima rivestimento del vetrino con fibronectina (i punti 2.1 o 2.2) non era efficiente, le cellule multimediali contenenti che è posto sul vetrino perderà la sua tensione superficiale ed espandere la bordi del vetrino, riducendo la densità delle cellule sul vetrino. Un metodo per risolvere questo potenziale problema è quello di aspirare il contenuto del vetrino e poiposizionare il coprioggetto (ancora nel suo piatto 35 mm) nella parte posteriore del cabinet biosicurezza per 5-10 min. Questo adattamento può aiutare a permettere il flusso d'aria all'interno dell'armadio per assistere essiccazione del piatto. Se qualsiasi liquido visibile rimane sul vetrino dopo l'asciugatura all'aria, aspirare le macchie di liquido e di nuovo lasciare asciugare all'aria per 5-10 minuti supplementari nell'armadio biosicurezza. È importante notare che non vi è alcun modo per evitare completamente questo potenziale problema, ma non diventa un problema minore con pratica ripetuta del protocollo. E 'anche una raccomandazione guasti che quando si prepara lamelle per il saggio migrazione cellulare (o qualsiasi test, in generale), per preparare coprioggetto supplementari e hanno HUVECs supplementari ready-to-go in caso di problemi lungo la strada.

Con queste considerazioni la risoluzione dei problemi in mente, è anche importante sottolineare l'utilità dei protocolli discussi e le loro implicazioni in futuro la ricerca biologia cellulare. L'applicabilità alla polyacrapproccio ylamide è ampia, e comprende non solo gli studi bidimensionali di impegno cellula-ECM (sopra descritta), ma anche le indagini tridimensionali 5. Questa applicazione è fondamentale per aumentare la nostra comprensione di come HUVECs regolano la forma delle cellule e la migrazione in ambienti fisiologici e dovrebbe fornire gli investigatori una conoscenza di base di come i cambiamenti morfologici sono coordinati con i cambiamenti del citoscheletro. Mentre i protocolli descritti qui si concentrano su misure della dinamica di crescita MT, la maggior parte dei protocolli può e deve essere adattato a misurare qualsiasi numero di altri aspetti microscopicamente misurabili di interazioni cellula-ECM. Per quanto riguarda la dinamica MT, ci sono numerose mappe, di cui almeno 14 famiglie di kinesins 89, ciascuno con un ruolo potenziale nel contribuire alla HUVEC polarità e la migrazione diretta, e ognuno dei quali può essere studiati utilizzando i protocolli presentati.

Future indagini dovrebbe unLSO essere mirati al coinvolgimento cellula-ECM in normale contro gli stati malati. protocolli HUVEC qui presentati sono applicabili alle indagini delle normali processi omeostatici vascolari, nonché di stati patologici, tra cui le malattie cardiache, la retinopatia, la crescita del tumore e metastasi, per citarne alcuni. Coniugando visibilmente trasparenti ECM e poliacrilammide substrati di conformità suscettibili di studi microscopici permetterà cellula-ECM studi impegno tale che l'angiogenesi vascolare endoteliale può essere monitorato con elevata risoluzione spaziale e temporale. Questi tipi di approcci sperimentali hanno già cominciato a rivelare importanti differenze di forma delle cellule endoteliali, la polarità, la migrazione e gli effetti delle proteine ​​che regolano questi processi 5,31,90. Gli sforzi futuri devono mirare ad identificare come la combinazione di conformità ECM e dimensionalità mechanosensing può servire a livello locale proteine ​​di controllo che prendono di mira e regolano la dinamica del citoscheletro.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Un ringraziamento particolare al Dr. Chiara M. Waterman per tutoraggio e le discussioni, Michelle Baird e Mike Davidson per fornire molti dei costrutti cDNA fluorescenti utilizzati in questi studi, e Kathryn Applegate e Gaudenz Danuser per lo sviluppo di software per l'analisi plusTipTracker MT. Questo lavoro è stato sostenuto, in parte, da una sovvenzione di KAM dal National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) e il National Institutes of Health (NIH). (Grant: 4K22HL113069).

Materials

Aurora A Inhibitor I Selleck Chemicals S1451
2% Bis solution Bio-Rad 1610142
3-aminopropyltrimethyloxysilane Sigma-Aldrich A3648
40% acrylamide Bio-Rad 1610140
405, 488, 561, 640 nm high power MLC400 laser combiner module Agilent Technologies 99462
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
anti–mouse IgG immunoprecipitation beads TrueBlot Reagents; Rockland Inc. 88-1688-31
anti–rabbit IgG immunoprecipitation beads TrueBlot Reagents; Rockland Inc. 88-7788-31
ET455/50m, DAPI-ET Emission Filter Chroma Technology Corp. ET455/50m
ET525/36m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET525/36m
ET605/70m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET605/70m
ET700/75m Emission Filter Chroma Technology Corp. ET700/75m
Bovine Serum Albumin Fraction V RPI Products A30075-100.0
Clara cooled charge-coupled device camera Andor Technology 77026010
Cy3 donkey anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 711-165-152
DPBS Thermo Fisher Scientific 14190250
Dyelight 649 goat anti-rat Jackson ImmunoResearch 112-496-068
EGM-MV SingleQuot Supply & Growth Factors (contents shown below) Lonza CC-4143
Fetal bovine serum 25 mL
Bovine brain extract 2.0 mL
Gentamycin sulfate 0.5 mL
Epidermal growth factor 0.5 mL
Hydrocortisone 0.5 mL
Penicillin/Streptomycin (10,000 IU Pen/mL, 10,000 ug Strep/mL)  10.0 mL
EGTA Sigma-Aldrich E3884-100G
Electronic shutter Sutter instrument 77016099
Fibronectin EMD Millipore FC010
Glutaraldehyde Thermo Fisher Scientific S80026
HALT Protease inhibitor Thermo Fisher Scientific PI-78425
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HRP goat anti-mouse Jackson ImmunoResearch 115-036-062
HRP goat anti-rabbit Jackson ImmunoResearch 111-036-045
Immuno-Blot PVDF Membrane Bio-Rad 162-0174
Lanolin Thermo Fisher Scientific 8006-54-0
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M2643-500G
Microscope Nikon TiE MEA53100
Motorized stage ASI Technologies MS-2000
Mounting medium Dako CS70330-2
Mouse anti-Aurora A Abcam ab130156
Mouse anti-GAPDH Abcam ab9484
Mouse anti-MCAK Abcam ab50778
Mouse anti-tubulin (DM1A) Cell Signaling Technology 3873S
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
NIS Elements software Nikon MQS310000
Nucleofector Kit V Lonza VACA-1003 Contains the electroporation buffer
Paraffin Thermo Fisher Scientific P31-500
Penicillin-Streptomycin (10,000IU Pen/mL,10,000ug Strep/mL) MP Biomedicals 91670249
Petroleum jelly Dow Corning 2021854-1113
Pipes Sigma-Aldrich P6757-100G
plusTipTracker
Rabbit anti-GFP Abcam ab290
Rabbit anti–pT288–Aurora A Abcam ab18318
Rat anti–α-tubulin AbD Serotec MCA78G
Sodium borohydride Thermo Fisher Scientific 678-10
Spinning disk  Andor Technology Yokagawa CSU-X1
Sulfo-SANPAH Thermo Fisher Scientific PI-22589
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific BP151-500
Trypsin Corning MT25053CI
Tween-20 Thermo Fisher Scientific BP337
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Braun, A., Caesar, N. M., Dang, K., Myers, K. A. High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (114), e54265, doi:10.3791/54265 (2016).
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