Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.
Человеческий мозг является высокое потребление энергии орган, который в основном опирается на глюкозу в качестве источника топлива. Глюкоза катаболизируется митохондрий мозга с помощью гликолиза, пути три-карбоновой кислоты (ТСА) цикл и окислительного фосфорилирования (OXPHOS) для получения клеточной энергии в виде аденозинтрифосфата (АТФ). Нарушение митохондриальной АТФ вызывает митохондриальных нарушений, которые представляют клинически с видными неврологическими и миопатии симптомов. Митохондриальные дефекты также присутствуют в неврологическими расстройствами (например , расстройства спектра аутизма) и нейродегенеративных расстройств (например , боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера и болезни Паркинсона). Таким образом, существует повышенный интерес к области для проведения 3D анализа митохондриальной морфологии, структуры и распределения в рамках обоих здоровых и болезненных состояний. Мозг митохондриальная морфологии чрезвычайно разнообразны, с некоторыми митохондрии особенно всинаптической области находится в диапазоне от <диаметром 200 нм, что ниже предела разрешения традиционной световой микроскопии. Выражая митохондрии нацеленную зеленый флуоресцентный белок (GFP) в головном мозге значительно повышает органоидного обнаружение с помощью конфокальной микроскопии. Тем не менее, оно не устраняет ограничения на чувствительность обнаружения относительно небольших размеров митохондрий без oversaturating образы больших размеров митохондрий. В то время как последовательная передача электронной микроскопии была успешно использована для описания митохондрии на нейронном синапсе, этот метод очень много времени, особенно при сравнении нескольких образцов. Метод последовательного блок-лицо сканирующей электронной микроскопии (SBFSEM) включает в себя автоматизированный процесс секционирования, блоки формирования изображения ткани и сбора данных. Здесь мы приводим протокол для выполнения SBFSEM из определенной области от мозга грызуна быстро реконструировать и визуализировать митохондриальной морфологии. Эта технологияNique также может быть использован для обеспечения точной информации о митохондриальной номер, объем, размер и распределение в определенной области мозга. Так как полученное разрешение изображения высокое (как правило, до 10 нм), также могут быть обнаружены какие-либо грубые митохондриальные морфологические дефекты.
Митохондрии являются динамическими органеллы , которые изменяют свою форму и расположение в зависимости от сотовой связи киев и потребностей, в тесном взаимодействии с цитоскелета клетки, и в ответ на клеточных событий , таких как токи кальция в нейронах 1. Митохондрии также взаимодействовать с другими клеточные органеллы , например , эндоплазматический ретикулум, что , в свою очередь , регулирует их динамику и метаболизм 2. Митохондриальная морфология показывает гетерогенность в различных типах клеток т.е.. форма органеллы изменяется от трубчатой до , что состоящие из листов, мешков и овалы 3. Было показано , что митохондриальные синтеза и деления белков цикл может регулировать местоположение, размер, форма и распределение митохондрий 4. Более того, изменения в митохондриальной формы связаны с нейродегенерации, нейрональной пластичности, мышечной атрофии, кальциевой сигнализации, генерации активных форм кислорода, а также продолжительность жизни и гибели клеток вовлекая тхаТ – клеток специфических митохондриальная морфологии имеет решающее значение для поддержания нормальной клеточной функции 5-11.
Одна из основных биоэнергетической функция митохондрий является создание аденозинтрифосфата (АТФ), выполнив ряд метаболических реакций , которые включают полный распад питательных веществ (т.е. глюкоза, жирные кислоты или амино-кислоты) через ЦТК и OXPHOS путей 12. Человеческий мозг составляет лишь 2% от массы тела , однако он потребляет ~ 20% от общего объема произведенной энергии делает его чрезвычайно энергию с требованием органа 13. Поэтому не удивительно , что митохондриальной дисфункцией у человека приводит к большому числу неврологических проявлений 14-17 лет. Генетические мутации в компонентах OXPHOS , которые ослабляют приводит АТФ поколения к митохондриальных нарушений 17,18, которые клинически гетерогенную группу расстройств с преобладанием ~ 1: 5000 человек, и одна из наиболее распространенных причин мetabolic расстройства у детей и взрослых. Дефицит митохондрии происхождения АТФ влияет на несколько органов и систем с требовательными органов высоких энергий , таких как мозг, сердце и скелетных мышц будучи преимущественно затронуты в этих больных 14,17,18. В последние годы, несколько исследований были получены данные для митохондриальной дисфункции у обоих неврологическими и нейродегенеративные расстройства 15-17,19,20. Поскольку митохондрии являются существенными и решающее значение для развития и функционирования мозга, что необходимо разработать протоколы, которые могут анализировать изменения мозга митохондриальной морфологии, структуры, размера, количества и распределения по обоим здоровых и больных состояний. Мышиные модели с митохондриях-целевой зеленого флуоресцентного белка (GFP) были произведены для визуализации митохондриальные движения и локализации в головном мозге 21,22. Хотя это является чрезвычайно полезным инструментом для изучения митохондриальной моторику и общее распределение, есть некоторые недостатки, которые входите ограниченное разрешение и чувствительность флуоресцентной микроскопии. Эти свойства делают его трудно отследить относительно небольшие митохондрии размера. Аналогичным образом , последовательная передача электронной микроскопии была успешно использована для просмотра синаптическую митохондрии 23, но этот метод очень много времени. Митохондриальная морфология , как известно, весьма динамично , как они проходят непрерывные деления и термоядерных циклов, и в большинстве клеток митохондрии поддерживать высокосвязных сети 24-26. Нейроны высоко поляризованные клетки с множественными дендритов и аксонов, протяженных и митохондрий , которые образуют соединение с сетью сетчатую в теле клетки , возможно , придется разделить , как они делают свой путь через эти невриты (рис 1). Это делает митохондрии мозга весьма разнообразные по форме и размеру. Например, с помощью последовательного блок-слойного сканирующей электронной микроскопии (SBFSEM) метод, ранее мы наблюдали, что разница в объеме или размер внесинаптического mitochondrIA в митохондриях , присутствующих в нервных окончаниях , может быть столько , сколько шестнадцать сгиб 27.
Есть несколько подходов к проведению анализа объема 28, который включает в себя последовательный раздел TEM 29, автоматизированная лента сбора ультрамикротоме SEM 30, сфокусированный пучок ионов SEM 31 и SBFSEM 32. Анализ SBFSEM имеет преимущества в том, что она имеет разрешение предоставлять количественные данные о морфологической формы, размера, распределения и числа органелл, таких как митохондрии в районах до 1 мм мозга. Техническая операция также наименее требовательным, с сбора и анализа данных в рамках возможностей многих биологических лабораторий, которые испытывают недостаток предыдущего опыта EM. Появление коммерческих инструментов для создания последовательных секций подобные изображения сделал 3D ультраструктурную анализ тканей рутинной техникой, которая дополнительно позволяет непредвзятый анализ объемный в быстрой и повторяемым способом 28 </SUP>. SBFSEM была впервые описана и используется в области нейробиологии в 2004 году 32, основанный на идее , введенной Лейтона в 1981 году 33. Несколько исследований с тех пор установили эту технику в качестве основного инструмента при анализе реконструкции нейронной цепи 34. Кроме того, для многих небольших масштабных проектов, обеспечивает анализ реконструкции для выявления клеточных органелл 27,35-39. Так, приобретенные изображения являются производными от низкого напряжения обратного рассеяния электронов, были разработаны новые протоколы окрашивания , которые сочетают в себе различные известные методы окраски тяжелых металлов , чтобы увеличить разрешение 40.
В этой статье мы приводим протокол для использования 3D электронной микроскопии и обработки изображений объемный анализ митохондрий мозга , основанный на методах, которые ранее были использованы нами и другими 38,39,41. Методы ткани после обработки , используемые были , как описано ранее Deerinck и др40.
Сложность нервной системы представляет собой значительную проблему в реконструкции больших объемов тканей и анализа морфологии и распределения органелл, таких как митохондрии с достаточным разрешением. Несколько клеток включая нейроны, олигодендроциты и астроциты с многочисленным…
The authors have nothing to disclose.
We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).
C57BL/6J mice | Jackson laboratory | 664 | |
Isoflurane | VETone, tradename Fluriso | 501017 | |
Dissection tray | Fisher scientific | S65105 | |
Dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
Butterfly canula | Exel International | 26704 | |
Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
Filter (0.45 micron) | EMD Millipore | NC0813356 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
Vibratome sectioning system | Ted Pella Inc. | Vibratome 3000 | |
Sodium Cacodylate | EMS | 12300 | |
Tannic Acid | EMS | 21700 | |
Potassium Ferrocyanide | J.T. Baker | 14459-95-1 | |
Osmium Tetroxide 4% Solution | EMS | 19150 | |
Thiocarbohydrazide | EMS | 21900 | |
L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A93100 | |
Potassium Hydroxide | Acros Organics | 43731000 | |
Lead Nitrate | EMS | 17900 | |
EMbed-812 EMBEDDING KIT | EMS | 14120 | Contains Embed 812 resin, DDSA, NMA, and DMP-30. |
Glutaraldehyde 25% EM Grade | Polysciences Inc. | 1909 | |
Paraformaldehyde | EMS | 19202 | |
Uranyl Acetate | EMS | 22400 | |
Ethanol | EMS | 15055 | |
Propylene Oxide | EMS | 20400 | |
Embedding Mold | EMS | 70907 | |
Aluminum specimen pin | EMS | 70446 | |
Colloidal Silver Liquid | EMS | 12630 | |
Razor | EMS | 72000 | |
Super Glue (Loctite Gel Control) | Loctite | 234790 | Hardware/craft stores carry this item |
Conductive epoxy | Ted Pella Inc. | 16043 | |
Scanning electron microscope | Zeiss | Sigma VP | |
In chamber ultramicrotome for SEM | Gatan Inc. | 3View2 | Can be designed for other SEMs |
Trimming microscope for pin preparation | Gatan Inc. | supplied as part of 3View system | |
Low kV backscattered electron detector | Gatan Inc. | 3V-BSED | |
ImageJ/ Fiji processing package | ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 | http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf | |
http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |||
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf | |||
http://fiji.sc/TrakEM2 |