Uiterst gevoelige en Rapid fluorescentiedetectie met een Portable FRET Analyzer
概要
Dit protocol beschrijft een snelle en gevoelige kwantificatie van Förster resonantie energieoverdracht (FRET) sensorgegevens met een maat draagbare FRET analyzer. De inrichting werd gebruikt voor maltose binnen een kritisch temperatuurtraject dat detectiegevoeligheid maximaliseert, zodat praktische en efficiënte evaluatie van het suikergehalte detecteren.
Abstract
Recente verbeteringen in Förster resonantie energieoverdracht (FRET) sensoren gebruik ervan nodig om verschillende kleine moleculen zoals ionen en aminozuren te detecteren. Echter, de aangeboren zwak signaal intensiteit van FRET sensoren is een grote uitdaging dat hun aanvraag voorkomt op diverse terreinen en maakt het gebruik van dure, high-end nodig fluorometers. Eerder hebben we een rendabele en krachtige FRET analyzer die specifiek de verhouding van twee emissiegolflengte banden (530 en 480 nm) kunnen meten hoge detectiegevoeligheid bereiken. Recenter werd ontdekt dat FRET sensoren met bacteriële periplasmatische bindende eiwitten te detecteren liganden met maximale gevoeligheid in het kritische temperatuurgebied van 50-55 ° C. Dit rapport beschrijft een protocol voor het beoordelen van het suikergehalte in de handel verkrijgbare drank monsters met behulp van onze draagbare FRET analyser met een temperatuur-specifieke FRET sensor. Onze resultaten toonden dat de extra voorverwarmingproces van de FRET sensor verhoogt het FRET-ratio-signaal, om meer accurate meting van het suikergehalte in te schakelen. De op maat gemaakte FRET analyzer en sensor werden met succes toegepast op het suikergehalte te kwantificeren in drie soorten commerciële dranken. We verwachten dat een verdere verkleining en de verbetering van de prestaties van de apparatuur het gebruik van hand-held analyzers in omgevingen zal vergemakkelijken, waar high-end apparatuur is niet beschikbaar.
Introduction
Förster resonantie energieoverdracht (FRET) is op grote schaal gebruikt als een biometrische sensor om kleine moleculen zoals suikers, calciumionen en aminozuren 1-4 detecteren. FRET biosensoren bevatten fluorescerende eiwitten, cyaan fluorescerend eiwit (CFP), en geel fluorescerende eiwitten (YFPs), die zijn gefuseerd aan beide uiteinden van periplasmische bindende eiwitten (PBP's). Suikers binden aan PBP's in het midden van de FRET sensor, waardoor structurele veranderingen in de sensor die vervolgens de afstand en de overgang dipool oriëntatie van de twee fluorescerende eiwitten aan weerszijden van de PBP veranderen. Deze wijziging maakt kwantitatieve analyse van het suikergehalte door meting van de verhouding van de emissie golflengten van EYFP (530 nm) en ECFP (480 nm). Vanwege de hoge gevoeligheid, specificiteit, real-time monitoring capaciteit en snelle responstijd van FRET biosensoren, worden deze sensoren op grote schaal gebruikt in milieu, industriële en medische toepassingen 5. Bovendien ratiometric meting met FRET biosensoren heeft belangrijke praktische voordelen, omdat het kan worden gebruikt om componenten in complexe biologische monsters waarbij de concentratie sensor niet gemakkelijk kan worden gecontroleerd en achtergrondfluorescentie is altijd aanwezig meten.
Ondanks deze voordelen van FRET-gebaseerde sensoren voor de kwantitatieve visualisatie, kleine structurele veranderingen met onvolledige domein motion-transfer naar de fluorescerende eiwitten te produceren inherent zwak signaal intensiteit. Dit zwakke signaal beperkt de toepassing van FRET-gebaseerde sensoren voor in vitro of in vivo analyse 6. Bijgevolg meeste FRET biosensoren vereisen het gebruik van dure en zeer gevoelige apparatuur. Eerder hebben wij een goedkoop en draagbaar FRET analyzer met mogelijkheden vergelijkbaar met die van de bestaande fluorescentie analysatoren 7. In deze inrichting, goedkope 405 nm-band ultraviolet licht-emitterende diode (LED) werd gebruikt als lichtbron voor excitatie van th veroorzakene fluorescentiesignaal, vervanging van een dure lamp of laser. Het detectiesysteem van de analysator efficiënt richt de dissiperende fluorescentiesignaal op twee fotodetectoren met een silicium fotodiode. In een meer recente studie hebben we aangetoond dat optimalisering van detectie temperatuur op 50 – 55 ° C aanzienlijk kunnen vergroten de ratiometrische FRET signaal 8. Deze temperatuur-specifieke signaalversterking, samen met de op maat gemaakte FRET analyzer, maakt het gebruik van FRET sensoren algemenere diagnostische toepassingen met een snelle en hoge gevoeligheid.
In dit protocol hebben we aangetoond dat de algemene toepasbaarheid van de FRET analyzer onder optimale omstandigheden FRET temperatuur door het kwantificeren van het suikergehalte van de handel verkrijgbare dranken. Dit protocol geeft de details van de werking FRET apparaat, alsook een korte beschrijving van sensor en monstervoorbereiding. We verwachten dat dit verslag van de mogelijke toepassing van de draagbare zal bevorderenanalyzer in kleinschalige laboratorium omgevingen en bieden een basis voor verdere ontwikkeling van een goedkope on-site diagnostisch apparaat met FRET-gebaseerde biosensoren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol maakt een snelle en efficiënte kwantificatie van het suikergehalte in drank monsters, met een maat FRET analysator 7 bij een optimale temperatuur voor FRET sensoren. De analyser is ontworpen met een recent ontwikkelde, goedkope 405-nm-band ultraviolet-LED als lichtbron en twee fotodetectoren met een silicium fotodiode. Dit apparaat is kosteneffectiever dan andere vergelijkbare fluorometers. De inrichting vertoonde hoge detectiegevoeligheid, bijzonder bij het meten van de verhouding van twee golf…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door subsidies van de Intelligent Synthetic Biology Center van Global Frontier Project (2011-0031944) en de KRIBB Research Initiative Program.
Materials
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
参考文献
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
- Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
- Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
- Gam, J., Ha, J. -. S., Kim, H., Lee, D. -. H., Lee, J., Lee, S. -. G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
- Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
- Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
- . Fluorescent Protein Guide: Biosensors Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015)
- Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
- Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
- Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
- Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children’s dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
- Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
- Melkko, S., Neri, D., Vaillancourt, P. E. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. , 69-77 (2003).
