حساسة للغاية وسريع كشف الإسفار مع محلل الحنق المحمولة
概要
يصف هذا البروتوكول الكمي السريع وحساسة للغاية من فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) بيانات الاستشعار باستخدام المحمولة محلل الحنق حسب الطلب. تم استخدام جهاز لكشف المالتوز ضمن نطاق درجة الحرارة الأهمية بمكان أن يزيد حساسية الكشف، مما يتيح تقييم عملي وفعال من محتوى السكر.
Abstract
التحسينات التي حدثت مؤخرا في فورستر نقل الطاقة الرنين مكنت (الحنق) أجهزة الاستشعار استخدامها للكشف عن جزيئات صغيرة مختلفة بما في ذلك الأيونات والأحماض الأمينية. ومع ذلك، فإن الفطرية ضعف كثافة إشارة من أجهزة الاستشعار الحنق هو التحدي الرئيسي الذي يمنع تطبيقها في مختلف المجالات، ويجعل من استخدام مكلفة، الراقية الفلورية اللازمة. سابقا، قمنا ببناء فعالة من حيث التكلفة وعالية الأداء محلل الحنق التي يمكن قياس على وجه التحديد نسبة اثنين من الانبعاثات العصابات الطول الموجي (530 و 480 نانومتر) لتحقيق حساسية الكشف عالية. وفي الآونة الأخيرة، تم اكتشاف أن أجهزة الاستشعار الحنق مع البروتينات ملزمة محيط بالجبلة البكتيرية كشف بروابط مع أقصى قدر من الحساسية في نطاق درجات الحرارة الحرجة من 50 – 55 درجة مئوية. ويصف هذا التقرير بروتوكول لتقييم محتوى السكر في عينات المشروبات المتاحة تجاريا باستخدام لدينا المحمولة محلل الحنق مع جهاز استشعار الحنق-درجة حرارة معينة. وأظهرت نتائجنا أن التسخين الإضافيعملية استشعار الحنق يزيد بشكل كبير من الحنق نسبة الإشارة، إلى تمكين قياس أكثر دقة من محتوى السكر. طبقت الحنق محلل حسب الطلب وأجهزة الاستشعار بنجاح لقياس نسبة السكر في ثلاثة أنواع من المشروبات التجارية. ونحن نتوقع أن المزيد من خفض حجم وأداء تعزيز المعدات وتسهيل استخدام تحليل باليد في بيئات حيث المعدات الراقية لم يعد متوفرا.
Introduction
فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) وقد استخدم على نطاق واسع الاستشعار البيومترية للكشف عن جزيئات صغيرة مثل السكريات، وأيونات الكالسيوم، والأحماض الأمينية 1-4. أجهزة الاستشعار الحنق تحتوي على البروتينات الفلورية، البروتينات الفلورية السماوي (CFPs)، والبروتينات الفلورية الصفراء (YFPs)، والتي تنصهر فيها لطرفي البروتينات ملزم محيط بالجبلة (PBPs). السكريات ربط لPBPs تقع في منتصف استشعار الحنق، مما تسبب في تغييرات هيكلية لأجهزة الاستشعار التي تغير بعد ذلك التوجه المسافة والانتقال ثنائي القطب من اثنين من البروتينات الفلورية إما في نهاية PBPs. هذا التغيير يسمح التحليل الكمي للمحتوى السكر عن طريق قياس نسبة انبعاث موجات من EYFP (530 نانومتر) وECFP (480 نانومتر). ونظرا لحساسية عالية، والنوعية، والقدرة على رصد في الوقت الحقيقي، وزمن الاستجابة السريعة لهذه الأجهزة الحنق، وتستخدم هذه المجسات على نطاق واسع في التطبيقات البيئية والصناعية والطبية 5. وعلاوة على ذلك، ratiomقياس etric باستخدام أجهزة الاستشعار الحنق له فوائد عملية مهمة، كما أنها يمكن أن تستخدم لقياس المكونات في العينات البيولوجية المعقدة حيث تركيز استشعار لا يمكن السيطرة عليها بسهولة ومضان الخلفية هي دائما موجودة.
وعلى الرغم من هذه المزايا من أجهزة الاستشعار القائمة على الحنق لالتصور الكمي، والتغيرات الهيكلية صغيرة مع نطاق ناقصة حركة نقل إلى البروتينات الفلورية تنتج ضعيفة بطبيعتها كثافة الإشارة. هذه الإشارة الضعيفة تحد من تطبيق الاستشعار مقرها الحنق لفي المختبر أو في تحليل الجسم الحي (6). ونتيجة لذلك، فإن معظم الحنق أجهزة الاستشعار تتطلب استخدام معدات باهظة الثمن وحساسة للغاية. سابقا، وضعنا محلل الحنق غير مكلفة والمحمولة مع قدرات مماثلة لتلك التي تحليل مضان القائمة 7. في هذا الجهاز، وغير مكلفة 405 نانومتر الفرقة فوق البنفسجية التي ينبعث منها ضوء الصمام الثنائي (LED) كان يستخدم كمصدر للضوء أن يسبب الإثارة من اله إشارة مضان، لتحل محل مصباح مكلفة أو الليزر. نظام الكشف عن محلل تركز بكفاءة إشارة تشتيت مضان على اثنين من أجهزة الاستشعار البصرية مع الثنائي الضوئي السيليكون. في دراسة حديثة، أظهرنا أن التحسين من درجة حرارة كشف في 50 – 55 درجة مئوية يمكن أن تضخيم كبير في ratiometric إشارة الحنق 8. هذا التعزيز إشارة درجة حرارة معينة، جنبا إلى جنب مع الحنق محلل حسب الطلب، يمكن استخدام أجهزة الاستشعار الحنق في التطبيقات التشخيصية أكثر عمومية مع حساسية السريعة والعالية.
في هذا البروتوكول، أثبتنا انطباق العام للمحلل الحنق في ظل ظروف درجة الحرارة المثلى الحنق عن طريق قياس كمية السكر من المشروبات المتاحة تجاريا. وينص هذا البروتوكول على تفاصيل العملية جهاز الحنق، وكذلك وصفا موجزا من أجهزة الاستشعار وإعداد العينات. ونحن نتوقع أن هذا التقرير سيعزز إمكانية تطبيق المحمولةمحلل في بيئات المختبرات الصغيرة وتوفير أساس لمزيد من تطوير جهاز غير مكلف في الموقع التشخيص مع أجهزة الاستشعار القائمة على الحنق.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح هذا البروتوكول الكمي السريع والفعال للمحتوى السكر في عينات المشروبات، وذلك باستخدام حسب الطلب الحنق محلل 7 في درجة حرارة مثلى لأجهزة الاستشعار الحنق. وقد تم تصميم محلل مع الآونة الأخيرة نموا، وغير مكلفة 405 نانومتر الفرقة الأشعة فوق البنفسجية الصمام كمصدر …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من المنح المقدمة من مركز علم الأحياء الاصطناعية الذكية من المشروع العالمي الحدودي (2011-0031944) وبرنامج مبادرة بحوث KRIBB.
Materials
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
参考文献
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
- Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
- Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
- Gam, J., Ha, J. -. S., Kim, H., Lee, D. -. H., Lee, J., Lee, S. -. G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
- Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
- Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
- . Fluorescent Protein Guide: Biosensors Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015)
- Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
- Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
- Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
- Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children’s dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
- Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
- Melkko, S., Neri, D., Vaillancourt, P. E. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. , 69-77 (2003).
