Exon skipping è attualmente un'opzione terapeutica più promettente per distrofia muscolare di Duchenne (DMD). Per espandere l'applicabilità per pazienti DMD e per ottimizzare la stabilità / funzione delle proteine distrofina troncate risultanti, un multi-esone skipping approccio utilizzando cocktail oligonucleotidi antisenso stato sviluppato e abbiamo dimostrato salvataggio distrofina sistemica in un modello del cane.
Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una delle malattie genetiche letali più comuni in tutto il mondo, causata da mutazioni nel gene della distrofina (DMD). Exon skipping impiega breve DNA / RNA-come le molecole chiamate oligonucleotidi antisenso (AONs) che ripristinano il quadro di lettura e di produrre le proteine più brevi ma funzionali. Tuttavia, esone skipping terapia deve affrontare due ostacoli principali: limitata applicabilità (fino a solo il 13% dei pazienti possono essere trattati con un singolo farmaco AON), e la funzione delle proteine incerta troncati. Questi problemi sono stati affrontati con un approccio cocktail AON. Mentre circa il 70% dei pazienti DMD possono essere trattati con sola skipping esone (tutti gli esoni combinati), si potrebbe potenzialmente trattare più del 90% dei pazienti DMD se esone skipping multipli usando cocktail farmaci antisenso può essere realizzato. Il cane X-linked distrofia muscolare (CXMD) modello di cane, il cui fenotipo è più simile a pazienti DMD umani, è stato utilizzato per testare la effic sistemicaACY e la sicurezza di multi-exon skipping degli esoni 6 e 8. modello cane Il CXMD ospita un sito di splice mutazione in introni 6, che porta ad una mancanza di esone 7 in distrofina mRNA. Per ripristinare la fase di lettura CXMD richiede multi-exon skipping degli esoni 6 e 8; Pertanto, CXMD è un buon modello animale di medie dimensioni per testare l'efficacia e la sicurezza di multi-exon skipping. In questo studio, un cocktail di Morpholinos antisenso di targeting esone 6 e esone 8 è stato progettato e restaurare l'espressione della distrofina nei muscoli scheletrici wide-body. Metodi di trasfezione / iniezione di oligonucleotidi cocktail e valutazione dell'efficacia e della sicurezza di multi-exon skipping nel modello cane CXMD sono presentati.
Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia muscolare recessiva X-linked caratterizzata da debolezza muscolare progressiva, in primo luogo descritto dal Dr. Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne (de Boulogne) 1. DMD è una malattia genetica comune che colpisce circa 1 bambino su 3500 in tutto il mondo, con circa 20.000 bambini affetti nati ogni anno 2,3. Lo sviluppo del motore è in ritardo e disturbi dell'andatura sono visti nella prima infanzia 4, seguita da dipendenza sedia a rotelle sui primi anni dell'adolescenza. La morte si verifica in genere tra i 20 e 30 a causa di insufficienza respiratoria o cardiaca 5-8 tra. Non vi è attualmente alcuna cura per la DMD. Il trattamento con glucocorticoidi può rallentare la progressione della degenerazione muscolare in una certa misura, ma è associato a significativi effetti collaterali, tra cui obesità e diabete mellito 2,7,8. DMD deriva da mutazioni nel gene della distrofina (DMD), portando ad una perdita di Protei distrofina funzionalen. DMD è estremamente un grande gene con oltre 2 milioni di coppie di basi e 79 esoni 9,10. La cancellazione, senza senso, e duplicazione mutazioni che portano alla out-of-frame mutazioni sono la causa più comune del fenotipo DMD. Le regioni di esoni 3 – 9 e esoni 45 – 55 sono denominate "mutazione hotspots", come la maggior parte dei pazienti hanno mutazioni per delezione all'interno di queste porzioni del gene, portando a distrofina non funzionale in pazienti DMD 3,9,11-16. funzioni distrofina all'interno del complesso distrofina-glicoproteina (DGC), che ha un ruolo importante nella stabilizzazione della membrana muscolare. La N- e C-terminali sono i domini più importanti per la funzione, mentre il dominio asta centrale svolge un ruolo meno importante 3,9,17. L'osservanza di un fenotipo lieve associato con distrofia muscolare di Becker (BMD), che si traduce per lo più da mutazioni in-frame all'interno del gene DMD, ha ispirato l'applicazione di esone skipping per il trattamento di DMD. pazienti BMD hanno un ridotto, ma functional, la proteina distrofina che mantiene sia termini 3,6,18. Exon skipping, in teoria, in grado di ripristinare il quadro di lettura, con conseguente proteine distrofina funzionali accorciato, ma-simili a quelli visti in BMD 3,19.
Diversi tipi di oligonucleotidi antisenso (AONs) sono stati testati in studi clinici, tra cui fosforotioati 2'O-metilata (2'OMePS) e oligomeri phosphorodiamidate morpholino (PMO). Saltare esoni 51 e 53 che utilizzano questi AONs è stato esaminato e mentre i risultati sono promettenti, single-exon skipping ha limitato l'applicabilità, in quanto è di 3, 19, 20,21, 22-26 specifiche mutazione. Le domande rimangono anche sulla stabilità delle proteine distrofina accorciati derivanti prodotte da single-esone skipping 22,23. Inoltre, alcuni pazienti richiedono più di un singolo esone da saltare per ripristinare il quadro di lettura 3. Anche se tecnicamente più difficile, multi-exon skipping è un metodo chepotrebbe affrontare questi problemi 3,19. Multi-exon skipping è stato precedentemente dimostrato nel cane distrofici e linee di cellule umane in vitro. Inoltre, mdx52 X-linked modelli cane topo e canino distrofia muscolare (CXMD) sono stati utilizzati per studi in vivo 22, 24-27. Canine distrofia muscolare legata al cromosoma X Japan (CXMD J) beagle sono stati utilizzati qui, come il quadro di lettura di CXMD J può essere ripristinato da Multi-exon skipping degli esoni 6 e 8, o esoni aggiuntivi (ad esempio, esoni 3-9) (Figura 1). Beagle-based CXMD condivide lo stesso schema mutazione come il modello Golden Retriever distrofia muscolare (GRMD), ma beagles sono più piccoli e meno costosi da mantenere a causa della loro dimensione del corpo, fornendo così un utile modello per DMD 28,29. Cani CXMD più da vicino imitare il fenotipo DMD umana rispetto ai modelli animali più piccoli, come roditori, e sono più affidabili per le valutazioni tossicologiche 3,22,30,31 </sup> (Figura 2). cani CXMD mostrano progressivo decadimento muscolare, disturbi della deambulazione, e problemi cardiaci e respiratori simili a quelli osservati in DMD. Rispetto al singolo-exon skipping, multi-exon skipping è applicabile a una percentuale molto maggiore di pazienti. Tra i tre tipi di mutazioni più comuni (delezioni, senza senso, e duplicazioni), 80-98% dei pazienti potrebbe essere trattata con multi-esone skipping 14,32,33, mentre il 45% di tutti i pazienti DMD potrebbe trarre vantaggio da esoni specificamente saltare 45 – 55 3,19,22,34.
Con lo sviluppo della morpholinos modificati, l'efficienza di cocktail AON a facilitare skipping esone è migliorata. Arginina-ricchi PMOs peptide coniugato cellule penetrante (PPMOs), e vivo-Morpholinos (vPMOs) sono chimiche AON che hanno notevolmente migliorato la capacità e la stabilità 3,35-38 cellula-penetrante. Le preoccupazioni rimangono circa la tossicità AON a lungo termine; Tuttavia, i progressi significativiè stato fatto. Modificazioni chimiche apportate al Morpholinos ridurre notevolmente gli effetti off-target e studi pre-clinici hanno riportato effetti tossici significativi 3,22,39,40. Una sfida rimanente per multi-esone skipping è il requisito corrente per ogni singolo AON da testare per la tossicità da solo, come un singolo farmaco, anziché insieme come un cocktail 3,19,22,41,42. In studi DMD che coinvolgono sia singolo e multi-esone skipping mirato al cuore, c'è stato un piccolo miglioramento nel tessuto cardiaco distrofici. L'efficacia di Morpholinos nel cuore è pensato per essere bassa a causa della scarsa capacità delle cellule-penetrante. PPMOs peptide coniugato hanno migliorato la capacità di AONs di penetrare cellule cardiache, aumentando la quantità di proteina distrofina funzionale salvato nel cuore 3,19,38.
Qui, il nostro approccio cocktail AON è discusso a lungo, compresa la progettazione di sequenze AON utilizzando il software ESEfinder 43. ProtoCOLS per esperimenti di cani con multi-exon skipping sono anche descritti. CXMD J beagles sono stati utilizzati per esoni 6 e 8 esperimenti saltare. Multi-esone skipping nel modello cane CXMD mostra risultati promettenti, ma le sfide restano che devono essere superate prima che siano clinicamente applicabile.
Exon skipping è una tecnica terapeutica promettente per il trattamento della DMD. Sia in vitro ed in vivo hanno dimostrato che il multi-esone skipping è fattibile. Qui, l'uso del modello del cane CXMD è discusso. In primo luogo, AONs sono stati progettati utilizzando i programmi di salvataggio-ESE e ESEfinder di indirizzare gli esoni distrofina 6 – 8. La chimica 2'OMePS AON è stato utilizzato per CXMD mioblasti trasfezione e la spina dorsale chimica morfolino AON è stato scelto per gli esperimenti in vivo. vPMOs sono più efficienti di PMOs non modificati, ma a causa della loro maggiore tossicità non sono adatti per iniezioni sistemiche. estrazione di RNA, RT-PCR, e cDNA sequenziamento sono state effettuate su mioblasti CXMD. I cani iniettati con il cocktail PMO erano clinicamente graduata per valutare un miglioramento dei sintomi clinici. Dopo che i cani sono stati umanamente eutanasia, campioni di muscolo sono stati prelevati e preparati per crio-sezionamento. L'emivita della proteina distrofina indotta da AOn è creduto di essere di circa 1 – 2 mesi. cani giovani adulti sono stati utilizzati in questo studio, anche se questi esperimenti può essere fatto con i cani neonatali e cani anziani (> 5 anni). Sezioni muscolari preparati sono stati utilizzati per valutare l'istopatologia e valutare salvataggio della proteina distrofina attraverso Western blotting ed immunoistochimica 48.
È importante garantire che il volume della soluzione PMO sia corretto prima iniezione; non riuscendo a farlo avrà effetti significativi sui risultati. Durante iniezioni intramuscolari, pressione sufficiente è necessario per entrare nelle fibre muscolari. Monitoraggio della salute del cane e l'ispezione del sito chirurgico sono importanti per la risoluzione dei problemi. Per monitorare la salute degli animali, gli esami del sangue settimanali e la pesatura devono essere eseguiti. Dopo euthanization dell'animale e preparazione dei campioni di muscolo, un passaggio critico per assicurare sensibilità nella rilevazione distrofina è di utilizzare sia il gel Tris-acetato e il metodo blotting semi-drydurante la procedura Western blotting.
Come mostrato nei risultati rappresentativi, mioblasti trattati con Ex6A, Ex6B, Ex8A, e il cocktail (contenente Ex6A, Ex6B, Ex8A, e Ex8B) prodotto in-frame DMD prodotti. Dal momento che Ex8B prodotto prodotti esone-saltato, non è stato utilizzato nei successivi esperimenti in vivo. cDNA sequenziamento ha dimostrato che esoni 6-9 salto si è verificato e immunocitochimica con DYS-2 ha mostrato colorazione restaurato espressione della distrofina nei campioni trattati. cani AON-trattati hanno mostrato un aumento significativo fibre distrofina-positive. Ciò indica che esoni 6-8 venivano saltati e una proteina accorciata è stato prodotto. La quantità di fibre distrofina-positive aumentata quando è stato usato un cocktail di AONs ed era proporzionale AON dosaggio. Immunoblot hanno mostrato un aumento dell'espressione della distrofina nei cani trattati con morpholino sistemici. Il muscolo scheletrico aveva livelli variabili di fibre distrofina; tuttavia, il tessuto cardiaco morfolino-trattati hanno mostrato pocomiglioramento dell'espressione della distrofina. Poiché distrofina ha un alto peso molecolare (427 kDa), rilevamento di piccole quantità di distrofina può essere difficile. Per i migliori risultati, sono stati usati gel Tris-acetato e il metodo di trasferimento semi-dry. HE macchiatura ha mostrato migliorato istopatologia nei cani morpholino-trattata. fibre in posizione centrale-nucleate (CNFs) sono un segno di muscolo malsano e rappresentano cicli di degenerazione muscolare e la rigenerazione. cani CXMD morfolino-trattati hanno mostrato una diminuzione della percentuale di CNFs rispetto ai cani CXMD non trattati. classificazione clinica ha rivelato un miglioramento dei sintomi, come l'aumento camminare e correre capacità, negli animali trattati con morpholino. La durezza dei muscoli è creduto per riflettere atrofia muscolare, in tal modo, è stato incluso nello schema di classificazione 59. La durezza della coscia (arti posteriori) dei muscoli è stata valutata; tuttavia, abbiamo escluso muscolo sartorio cranici perché tendono a mostrare l'ipertrofia piuttosto che l'atrofia in CXMD. cani trattati mostranocato punteggi più bassi di classificazione e aveva volte più veloce nel test di funzionamento 15 m. Volte migliorato il 15 m di prova sono indicativi di un miglioramento della funzione muscolare 40. Più alti punteggi complessivi di classificazione indicano cattive condizioni di salute e una maggiore atrofia muscolare.
Anche se questi risultati sono promettenti, multi-exon skipping presenta ancora molte sfide che dovranno essere superati prima che la tecnica ha applicabilità clinica. tessuto cardiaco mostra ancora ridotto assorbimento di AONs, probabilmente a causa della differenza di traffico cellulare tra tessuto cardiaco e scheletrico. Nessun effetto tossico è stato osservato negli animali sotto i regimi di dosaggio in corso; tuttavia, più lavoro deve essere fatto per valutare la tossicità a lungo termine prima che l'uso di cocktail AON può muoversi alla sperimentazione clinica. E 'difficile ottenere l'approvazione per AON farmaci cocktail perché le agenzie di regolamentazione definiscono ogni sequenza AON come farmaco unico. Ciò significa che ogni sequenza in un cocktail dovrebbe essere testato singolarmente per safety, che richiede più tempo e più soldi. Un'altra barriera all'utilizzo di multi-esone skipping in un ambiente clinico è una grande quantità di prodotti proteici intermedi prodotti con funzioni incognite. Queste proteine possono potenzialmente portare ad imprevedibili effetti collaterali, a seconda dell'individuo mutazione 22. Inoltre, i modelli di mutazione disponibili negli attuali modelli di cani distrofici sono limitati. Ci sono alcuni mutazioni in natura, e non tutte le mutazioni sono utili per studiare multi-esone skipping. Il modello suino distrofico promette di essere una buona alternativa per il futuro DMD exon skipping studi 33, 34.
I modelli cane DMD hanno alcuni vantaggi rispetto ad altri modelli DMD. Essendo un grande modello animale, classificazione clinica e la RM sono possibili, consentendo un'analisi più dettagliata. Poiché i cani sono grandi animali sono anche più adatti per studi tossicologici e più strettamente rappresentano la malattia umana rispetto al modello di topo. Cane modelli hanno anche sequenze geniche DMD che sono più simili agli esseri umani 23, 34, 45.
Anche se tecnicamente impegnativo, l'approccio multi-skipping esone potrebbe infine beneficiare> 90% dei pazienti DMD 24. Questo lo rende una migliore alternativa al single-exon skipping, come single-exon skipping è applicabile solo a un piccolo sottogruppo di pazienti. Inoltre, multi-exon skipping ci permetterà di selezionare i modelli di eliminazione che ottimizzano la funzionalità delle proteine distrofina accorciati. Ad esempio, la cancellazione di DMD esoni 45 – 55 è associata a sintomi lievi o eccezionalmente soggetti asintomatici 14,19,60-63. Il salto multi-esone di esoni 45 – 55 è già stata dimostrata in un modello murino di DMD con una esone 52 delezione (mdx52) utilizzando iniezioni sistemici di vPMOs 22,26. L'uso di vPMOs cocktail è stata dimostrata anche in altre forme di distrofia muscolare, qualicome Fukuyama distrofia muscolare congenita (FCMD). FCMD è causata da esone trapping, in cui aberranti splicing mRNA è causata da inserimento retrotrasposone. vPMOs hanno dimostrato di salvare il modello di splicing sia in un modello di FCMD mouse e in linee cellulari umane 64. Di prossima generazione chimiche AON espositrici maggiore efficacia e minore tossicità faciliterebbero la traduzione efficace dell'approccio multi-skipping esone in applicazioni cliniche. Inoltre, multi-esone skipping potrebbe potenzialmente essere applicata ad altre malattie genetiche, come la dysferlinopathies 24, 65.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by The University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse’s Journey – The Foundation for Gene and Cell Therapy, and the Women and Children’s Health Research Institute (WCHRI).
2'OMePS Transfection of Dog Myoblasts | |||
3ml 6 welled plates | IWAKI | 5816-006 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.01 | |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | 200 U/mL |
Lipofectin | Invitrogen | 18292-011 | Total volume of 100 mL in opti-MEM media at a ratio of 2:1 for lipofectin. 10 mL lipofectin for 5 mg RNA. |
2’OMePS | Eurogentec | Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU), and Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC). | |
Horse Serum | Gibco | 16050-114 | 2% |
streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 200 ug/mL |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Insulin | |||
Morpholino transfection of dog myoblasts | |||
All material from MePS Transfection of Dog Myoblasts for culturing | |||
Antisense morpholinos | Gene-tools |
Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC |
|
Endo-Porter | Gene-tools | ||
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Invitrogen | 15596-018 | 1mL/plate |
RNA Extraction and Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) | |||
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Invitrogen | 15596-018 | 1mL/plate |
Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | 200 uL |
1.5 ml Tubes | Eppendorf | 22363204 | |
Centrifudge | Beckman-Coulter | ||
75% Ethanol | Sigma-Aldrich | 34852 | |
UV Spectrometer | |||
Forward primer in exon 5 | Invitrogen | CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA 1.5 mL 10 mM |
|
Reverse primer in exon 10 | Invitrogen | TGCTTCGGTCTCTGTCAATG 1.5 L 10 mM |
|
dNTPS | Clontech | 3040 | |
One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
Thermo-cycler | Scinco | ||
Complementary DNA (cDNA) Sequencing | |||
Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
Centrifudge | |||
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337454 | |
Intramuscular injections or open muscle biopsy | |||
Surgical Tools | Scissors, Scapal, needle, surgical thread | ||
Vet Ointment | |||
Iodophors | webtextiles | 12190-71-5 | |
chlorohexidine | Peridex | 12134 | |
Surgical Drapes | |||
Srubs | |||
Facial Mask | |||
Surgical Gloves | |||
Head Covering | |||
Thiopental sodium | Mitsubishi Tanabe Pharma | 20 mg/kg | |
Isoflurane | Abbott laboratories | 05260-05 | 2-3% |
Antisense morpholinos | Gene-tools | Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT), Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC) Dilute to a final volume of 100 L in opti-MEM media. 120–200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline |
|
27G Needles | TERUMO | SG3-2325 | |
50 mL syringe | TERUMO | SG2-03L2225 | |
buprenorphine hydrochloride | |||
Tougne Depressor | |||
cephalexin | 15 to 30 mg/kg | ||
cefazolin | 15 to 30 mg/kg | ||
buprenorphine | 0.01 mg/kg | ||
buprenorphine hydrochloride | 0.02 mg/kg | ||
Systemic Injections | |||
Syringe infusion pump | Muromachi | ||
22G Indwelling needles | TERUMO | SG3-2225 | |
27G Needles | TERUMO | SG3-2325 | |
50 mL syringe | TERUMO | SG2-03L2225 | |
Saline | Ohtsuka-Pharmaceutical | 28372 | |
Clinical Grading of Dogs | |||
Video Camera | |||
Stop watch | |||
Magnetic resonance imaging (MRI) | |||
3 Tesla MRI l | |||
18 cm diameter/18 cm length human extremity coi | |||
Muscle sampling and preparation (necropsy) | |||
Thiopental sodium | Mitsubishi Tanabe Pharma | 20 mg/kg | |
Isoflurane | Abbott laboratories | 05260-05 | 2-3% |
Tragacanth gum | 10-20 mL | ||
Liqoud Nitrogrn | |||
Cork Discs | Iwai-kagaku | 101412-806 | |
Dry Ice | |||
Tweezers | |||
Poly-l-lysine–coated slides | Fisher | 22-037-216 | |
Cryostat Microsystem | Leica | cm1900 | |
Immunohistochemistry | |||
DYS1 | Novocastra | NCL-DYS1 | 1:150 dilutions |
DYS2 | Novocastra | NCL-DYS2 | 1:150 dilutions |
Alexa 594 goat antimouse IgG1 | Invitrogen | A-21125 | 1:2,500 dilutions |
Alexa 594 goat antimouse IgG2 | Invitrogen | A-11005 | 1:2,500 dilutions |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Contans mounting agent |
Goat Serum | Invitrogen | 10000C | 15% |
PBS | |||
Moisture chamber | Scientific Devise Laboratory | 197-BL | |
Chamber slide | Lab-tek | 154453 | |
Cover Glasses | Fisher | 12-540A | |
Hydrophobic barrier pen | |||
Flpurescent microcope | 594 nm at 20X magnification. | ||
Western Blotting | |||
Distillied Water | |||
Hand Homogenizer | |||
2× Laemmli SDS-loading buffer | 0.1 M Tris–HCl (pH 6.6), 2% (w/v) SDS, 2% (0.28 M) beta-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue | ||
SDS gels | Bio-Rad | 161-1210 | 5% resolving |
SDS gels | Invitrogen | Invitrogen, WG1601BOX | 3-8% |
PVDF membrane | GE | 10600021 | |
Methanol | |||
Transfer buffer (10×) | 250 mM of Tris-Base, 1,920 mM of Glycine | ||
Transfer buffer (1×) | 10% 10× buffer, 20% methanol | ||
0.05% PBS/Tween 20 (PBST) | 2,000 mL 3× 200 mL for washing |
||
PBST/5% milk powder | 100 mL | ||
Protein Assay Kit | BCA | T9650 | |
Tween 20 | Sigma | P5927 | |
Urea | Sigma | U5378 | |
Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
SDS | Sigma | L3771 | |
Tris-Acetate | Sigma | ||
Tris HCL | Sigma | T3253 | |
Glycerol | Sigma | G8773 | |
Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
NaCl | Sigma | S3014 | |
PMSF | Sigma | P7626 | |
Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
Cathode Buffer | .025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20 % Methanol | ||
desmin antibody | Abcam | ab8592 | |
DYS1 | Novocastra | NCL-DYS1 | 1:150 dilutions |
Image J Software |