Le saut d'exon est actuellement une option thérapeutique la plus prometteuse pour la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Pour étendre l'applicabilité des patients atteints de DMD et d'optimiser la stabilité / fonction des protéines de la dystrophine tronquée résultant, un multi-saut d'exon approche utilisant des oligonucléotides antisens cocktail a été développé et nous avons démontré systémique sauvetage de la dystrophine dans un modèle de chien.
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une des maladies les plus courantes létaux génétiques dans le monde entier, causées par des mutations dans le dystrophine (DMD) gène. Le saut d'exon emploie / molécules d'ARN-like ADN court appelés oligonucléotides antisens (AON) qui restaurent le cadre de lecture et produisent des protéines plus courtes mais fonctionnelles. Cependant, la thérapie de sauter exon se heurte à deux obstacles majeurs: applicabilité limitée (jusqu'à seulement 13% des patients peuvent être traités avec un seul médicament AON), et la fonction incertaine des protéines tronquées. Ces questions ont été abordées avec une approche cocktail AON. Alors qu'environ 70% des patients atteints de DMD peut être traitée par un simple saut d'exon (tous les exons combinés), on pourrait potentiellement traiter plus de 90% des patients atteints de DMD si exon multiples sauter à l'aide cocktail médicaments antisens peut être réalisée. a été utilisé La canine liée à l'X dystrophie musculaire (CXMD) modèle de chien, dont le phénotype est plus semblable aux patients DMD humains, pour tester l'effic systémiquealpha- et de sécurité multi-saut d' exon des exons 6 et 8. Le modèle de chien CXMD héberge une mutation du site d'épissage dans l' intron 6, conduisant à un manque de l' exon 7 dans l' ARNm de la dystrophine. Pour rétablir le cadre de lecture dans CXMD nécessite multi-exon skipping des exons 6 et 8; par conséquent, CXMD est un bon modèle animal de taille moyenne, pour tester l'efficacité et la sécurité des multi-saut d'exon. Dans l'étude actuelle, un cocktail de morpholinos antisens ciblant l'exon 6 et l'exon 8 a été conçu et restauré l'expression de la dystrophine dans les muscles squelettiques du corps entier. Méthodes de transfection / injection d'oligos de cocktail et de l'évaluation de l'efficacité et la sécurité des multi-saut d'exon dans le modèle de chien CXMD sont présentés.
Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie musculaire récessive liée à l' X caractérisée par une faiblesse musculaire progressive, d' abord décrit par le Dr Guillaume-Benjamin-Amand Duchenne (de Boulogne) 1. DMD est une maladie génétique fréquente qui touche environ 1 à 3.500 garçons à travers le monde, avec environ 20 000 enfants touchés nés chaque année 2,3. Le développement moteur est retardée et troubles de la marche sont vus dans la petite enfance 4, suivie par fauteuil roulant dépendance à peu près au début de l' adolescence. La mort survient généralement entre les âges de 20 et 30 en raison d' une insuffisance respiratoire ou cardiaque 5-8. Il n'y a actuellement aucun remède pour DMD. Le traitement par glucocorticoïdes peut ralentir la progression de la dégénérescence musculaire à un certain degré , mais est associé à des effets secondaires importants, y compris l' obésité et le diabète sucré 2,7,8. DMD résulte de mutations dans le dystrophine Duchenne (DMD) , le gène, ce qui conduit à une perte de dystrophine fonctionnelle protein. DMD est un très grand gène avec plus de 2 millions de paires de bases et 79 exons 9,10. Délétion, non-sens, et de duplication des mutations conduisant à des mutations hors-cadre sont la cause la plus commune du phénotype DMD. Les régions des exons 3 – 9 exons et 45 – 55 sont appelés "points chauds de mutation» , comme la plupart des patients présentent des mutations de deletion dans ces parties du gène, ce qui conduit à la dystrophine non fonctionnelle chez les patients souffrant de DMD 3,9,11-16. les fonctions de la dystrophine dans le complexe dystrophine-glycoprotéine (DGC), qui a un rôle important dans la stabilisation de la membrane musculaire. N- et C-terminales sont les domaines les plus importants pour la fonction, alors que le domaine de la tige centrale joue un rôle moins important 3,9,17. Le respect d'un phénotype doux associé à dystrophie musculaire de Becker (BMD), qui résulte principalement de mutations en cadre dans le gène DMD, inspiré de l'application de saut d' exon pour le traitement de la DMD. patients BMD ont un raccourci, mais functional, protéine dystrophine qui maintient deux extrémités 3,6,18. Le saut d' exon, en théorie, peut restaurer le cadre de lecture, ce qui entraîne la dystrophine protéines fonctionnelles raccourcies mais-similaires à ceux observés dans la DMO 3,19.
Plusieurs types d'oligonucléotides antisens (AON) ont été testés dans des essais cliniques, y compris phosphorothioates 2'O-méthylés (2'OMePS) et oligomères phosphorodiamidate morpholino (PMO). Exons Sauter 51 et 53 à l' aide de ces AON ont été examinés et alors que les résultats sont prometteurs, un seul saut d' exon a limité l' applicabilité, comme il est de 3, 19, 20,21, 22-26 mutation spécifique. Des questions subsistent également quant à la stabilité des protéines de dystrophine raccourcie résultant produites à partir de simple saut d' exon 22,23. En outre, certains patients ont besoin de plus d'un seul exon à être ignorées afin de rétablir le cadre de lecture 3. Bien que techniquement plus difficile, multi-saut d'exon est une méthode quipourrait remédier à ces problèmes 3,19. Multi-saut d' exon a déjà été démontrée chez le chien dystrophique et des lignées de cellules humaines in vitro. En outre, mdx52 dystrophie musculaire (CXMD) modèles de chien liées à l'X de la souris et canines ont été utilisées pour les études in vivo 22, 24-27. Canine dystrophie musculaire liée à l' X Japon (CXMD J) beagles ont été utilisés ici, comme le cadre de lecture de CXMD J peut être restauré par le multi-exon skipping des exons 6 et 8, ou exons supplémentaires (par exemple, les exons 3-9) (Figure 1). CXMD à base de Beagle partage le même type de mutation que le modèle Golden Retriever dystrophie musculaire (DRG), mais beagles sont plus petits et moins coûteux à entretenir en raison de la taille de leur corps, fournissant ainsi un modèle utile pour DMD 28,29. Chiens CXMD imitent plus étroitement le phénotype DMD humain que les modèles animaux plus petits, comme les rongeurs, et sont plus fiables pour les évaluations toxicologiques 3,22,30,31 </sup> (figure 2). chiens CXMD afficher la décomposition musculaire progressive, troubles de la marche, et les problèmes cardiaques et respiratoires semblables à ceux observés dans la DMD. Par rapport à un seul saut d'exon, multi-saut d'exon est applicable à une plus grande proportion de patients. Parmi les trois types de mutations les plus courantes (suppressions, non – sens, et duplications), 80-98% des patients pourraient être traités par le biais multi-saut d' exon 14,32,33, alors que 45% de tous les patients atteints de DMD pourrait bénéficier d'exons sauter spécifiquement 45 – 55 3,19,22,34.
Avec le développement des morpholinos modifiés, l'efficacité des cocktails AON à faciliter l'exon skipping est améliorée. Riche en arginine peptide conjugué PMO de pénétration cellulaire (PPMOs) et in vivo-morpholinos (vPMOs) sont chimies AON qui ont considérablement amélioré la capacité et la stabilité 3,35-38 pénétrant dans les cellules. Des préoccupations demeurent quant à la toxicité à long terme AON; Cependant, des progrès significatifsa été fait. Les modifications chimiques apportées à morpholinos diminuent grandement les effets hors-cible et des études pré-cliniques ont rapporté aucun effet toxique significatif 3,22,39,40. Un autre défi pour le multi-saut d' exon est l'exigence actuelle pour chaque single AON à tester la toxicité seul, comme un seul médicament, au lieu d'ensemble comme un cocktail 3,19,22,41,42. Dans les études DMD impliquant à la fois simple et multi-saut d'exon ciblé sur le cœur, il y a eu peu d'amélioration dans le tissu cardiaque dystrophique. L'efficacité de morpholinos dans le cœur est considéré comme faible en raison de la capacité de pénétration cellulaire pauvres. PPMOs peptidiques conjugués ont permis d' améliorer la capacité d'AON de pénétrer les cellules cardiaques, augmentant ainsi la quantité de protéine de dystrophine fonctionnelle secourue au coeur 3,19,38.
Ici, notre approche cocktail AON est longuement discuté, y compris la conception de séquences AON en utilisant le logiciel ESEfinder 43. Protocols pour des expériences de chien avec multi-saut d'exon sont également décrits. CXMD J beagles ont été utilisés pour les exons 6 et 8 expériences à sauter. Multi-saut d'exon dans le modèle de chien CXMD montre des résultats prometteurs, mais des défis demeurent qui doivent être surmontés avant qu'ils ne soient cliniquement applicables.
Le saut d'exon thérapeutique est une technique prometteuse pour le traitement de la DMD. In vitro et in vivo ont montré que le multi-saut d' exon est réalisable. Ici, l'utilisation du modèle de chien CXMD est discuté. Tout d' abord, AON ont été conçus à l' aide des programmes de sauvetage-ESE et ESEfinder pour cibler les exons de la dystrophine 6 – 8. La composition chimique 2'OMePS AON a été utilisée pour la transfection et CXMD myoblastes le squelette chimique morpholino AON a été choisi pour les expériences in vivo. vPMOs sont plus efficaces que les PMO non modifiés, mais en raison de leur toxicité plus élevée, ils ne sont pas appropriés pour les injections systémiques. extraction de l'ARN, une RT-PCR et séquençage d'ADNc ont été réalisées sur les myoblastes CXMD. Chiens injectés avec le cocktail PMO étaient cliniquement graduée pour évaluer toute amélioration des symptômes cliniques. Après les chiens ont été euthanasiés sans cruauté, des échantillons de muscles ont été prélevés et préparés pour cryo-tronçonnage. La demi-vie de la protéine dystrophine induite par unNRO est censé être environ 1 – 2 mois. chiens jeunes adultes ont été utilisés dans cette étude, bien que ces expériences peuvent être faites avec des chiens néonatales et les chiens âgés (> 5 ans). Sections musculaires préparées ont été utilisés pour évaluer l' histopathologie et évaluer protéine dystrophine sauvetage par Western blot et immunohistochimie 48.
Il est important de veiller à ce que le volume de la solution CPM est correcte avant les injections; à défaut de le faire aura des effets significatifs sur les résultats. Pendant les injections intramusculaires, une pression suffisante est nécessaire pour entrer dans les fibres musculaires. Surveillance de la santé et l'inspection du site de la chirurgie chien sont importants pour le dépannage. Pour surveiller la santé des animaux, des tests sanguins hebdomadaires et de pesage doivent être effectués. Après l'euthanasie de l'animal et la préparation des échantillons de muscle, une étape essentielle pour assurer la sensibilité dans la détection de la protéine dystrophine est d'utiliser à la fois le gel Tris-acétate et méthode de transfert semi-seclors de la procédure par Western Blot.
Comme on le voit dans les résultats représentatifs myoblastes traités avec Ex6A, Ex6B, Ex8A et le cocktail (contenant Ex6A, Ex6B, Ex8A et Ex8B) réalisé en cadre produits DMD. Depuis Ex8B produit aucun produit exon-sautée, il n'a pas été utilisé dans la suite des expériences in vivo. séquençage d'ADNc a montré que les exons 6-9 saut a eu lieu et immunocytochimie avec DYS-2 coloration a montré restauré l'expression de la dystrophine dans les échantillons traités. AON chiens traités ont montré une augmentation significative des fibres dystrophine positives. Cela indique que les exons 6-8 ont été ignorés et une protéine raccourcie a été produit. La quantité de fibres dystrophine positives augmenté quand un cocktail d'AON a été utilisé et est proportionnelle à la dose AON. Immunotransferts a montré une expression de la dystrophine a augmenté chez les chiens systémiques morpholino traités. Le muscle squelettique a des niveaux variables de fibres dystrophine; Cependant, le tissu cardiaque morpholino traité a montré peul'amélioration de l'expression de la dystrophine. Etant donné que la dystrophine présente un poids moléculaire élevé (427 kDa), la détection de faibles quantités de la dystrophine peut être difficile. Pour les meilleurs résultats, gel Tris-acétate et la méthode de transfert semi-sec ont été utilisés. HE coloration a montré l'amélioration de l'histopathologie chez les chiens morpholino-traités. fibres centre-nucléés (CNFS) sont un signe de muscle malsain et représentent des cycles de dégénérescence musculaire et la régénération. chiens CXMD morpholino-traités ont montré une diminution du pourcentage de CNF par rapport aux chiens CXMD non traités. classement clinique a révélé une amélioration des symptômes, tels que l'augmentation marche et la capacité en cours d'exécution, chez les animaux morpholino traités. La dureté des muscles est censé refléter l' atrophie musculaire, donc, il a été inclus dans le système de classement 59. La dureté de la cuisse (membres postérieurs) muscles a été évaluée; cependant, nous avons exclu les muscles sartorius crâniens parce qu'ils ont tendance à présenter une hypertrophie plutôt que dans l'atrophie CXMD. Les chiens traités montrented scores de classement inférieurs et avait fois plus rapide sur le test de roulage de 15 m. Amélioration fois sur le test de 15 m sont indicatifs de l' amélioration de la fonction musculaire 40. scores de classement globaux plus élevés indiquent une mauvaise santé et une augmentation de l'atrophie musculaire.
Bien que ces résultats sont prometteurs, multi-exon skipping présente encore de nombreux défis qui devront être surmontés avant que la technique a une applicabilité clinique. tissu cardiaque affiche toujours l'absorption réduite de AON, probablement en raison de la différence dans le trafic cellulaire entre le tissu cardiaque et squelettique. Aucun effet toxique n'a été observé chez les animaux de moins de posologies en cours; Cependant, plus de travail doit être fait pour évaluer la toxicité à long terme avant l'utilisation de cocktails AON peut se déplacer à des essais cliniques. Il est difficile d'obtenir l'approbation de médicaments AON cocktail parce que les organismes de réglementation définissent chaque séquence AON comme un médicament unique. Cela signifie que chaque séquence dans un cocktail devra être testé individuellement pour safety, ce qui nécessite plus de temps et plus d'argent. Un autre obstacle à l'utilisation de la multi-saut d'exon dans un environnement clinique est une grande quantité de produits protéiques produits intermédiaires avec des fonctions inconnues. Ces protéines peuvent potentiellement conduire à des effets secondaires imprévisibles, en fonction de la mutation individuelle 22. En outre, les profils de mutation disponibles dans les modèles actuels de chien dystrophiques sont limitées. Il existe peu de mutations naturelles, et non pas toutes les mutations sont utiles pour étudier plusieurs saut d'exon. Le modèle dystrophique de porc promet d'être une bonne alternative pour l' avenir DMD saut d' exon études 33, 34.
Les modèles de chiens DMD présentent certains avantages par rapport aux autres modèles de DMD. Être un plus grand modèle animal, le classement clinique et l'IRM sont possibles, ce qui permet une analyse plus détaillée. Puisque les chiens sont de grands animaux, ils sont également plus adapté pour les études toxicologiques et représentent plus étroitement la maladie humaine par rapport au modèle de la souris. Chien modèles ont aussi des séquences de gènes DMD qui sont plus semblables aux humains 23, 34, 45.
Bien que techniquement difficile, l'approche de saut multi-exon pourrait finalement bénéficier> 90% des patients atteints de DMD 24. Cela en fait une bien meilleure alternative à un seul saut d'exon, comme un seul saut d'exon est applicable uniquement à un petit sous-ensemble de patients. En outre, multi-exon skipping nous permettra de sélectionner les motifs de suppression qui optimisent la fonctionnalité des protéines de la dystrophine raccourcie. Par exemple, la suppression de la DMD exons 45 – 55 est associée à des symptômes exceptionnellement doux ou individus asymptomatiques 14,19,60-63. Le saut multi-exon des exons 45 – 55 a déjà été démontré dans un modèle de souris de la DMD avec un exon 52 délétion (mdx52) en utilisant des injections systémiques de vPMOs 22,26. L'utilisation de cocktails vPMOs a également été démontrée dans d'autres formes de dystrophie musculaire,comme Fukuyama dystrophie musculaire congénitale (FCMD). FCMD est provoquée par le piégeage d'exon, dans lequel l'épissage aberrant est provoquée par l'insertion de rétrotransposon. vPMOs ont été montrés pour délivrer le motif d'épissage dans les deux un modèle de souris FCMD et dans des lignées cellulaires humaines 64. La nouvelle génération AON chimies présentant une efficacité élevée et une toxicité plus faible faciliterait la traduction effective de l'approche de saut multi-exon dans l'application clinique. En outre, multi-saut d' exon pourrait être appliquée à d' autres troubles génétiques, tels que la dysferlinopathies 24, 65.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by The University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, The Friends of Garrett Cumming Research Chair Fund, HM Toupin Neurological Science Research Chair Fund, Muscular Dystrophy Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Jesse’s Journey – The Foundation for Gene and Cell Therapy, and the Women and Children’s Health Research Institute (WCHRI).
2'OMePS Transfection of Dog Myoblasts | |||
3ml 6 welled plates | IWAKI | 5816-006 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.01 | |
Penicillin | Sigma-Aldrich | P4333 | 200 U/mL |
Lipofectin | Invitrogen | 18292-011 | Total volume of 100 mL in opti-MEM media at a ratio of 2:1 for lipofectin. 10 mL lipofectin for 5 mg RNA. |
2’OMePS | Eurogentec | Ex6A (GUU GAUUGUCGGACCCAGCUCAGG), Ex6B (ACCUAUGA CUGUGGAUGAGAGCGUU), and Ex8A (CUUCCUGG AUGGCUUCAAUGCUCAC). | |
Horse Serum | Gibco | 16050-114 | 2% |
streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 200 ug/mL |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Insulin | |||
Morpholino transfection of dog myoblasts | |||
All material from MePS Transfection of Dog Myoblasts for culturing | |||
Antisense morpholinos | Gene-tools |
Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC |
|
Endo-Porter | Gene-tools | ||
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Invitrogen | 15596-018 | 1mL/plate |
RNA Extraction and Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) | |||
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Invitrogen | 15596-018 | 1mL/plate |
Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | 200 uL |
1.5 ml Tubes | Eppendorf | 22363204 | |
Centrifudge | Beckman-Coulter | ||
75% Ethanol | Sigma-Aldrich | 34852 | |
UV Spectrometer | |||
Forward primer in exon 5 | Invitrogen | CTGACTCTTGGTTTGATTTGGA 1.5 mL 10 mM |
|
Reverse primer in exon 10 | Invitrogen | TGCTTCGGTCTCTGTCAATG 1.5 L 10 mM |
|
dNTPS | Clontech | 3040 | |
One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
Thermo-cycler | Scinco | ||
Complementary DNA (cDNA) Sequencing | |||
Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
Centrifudge | |||
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337454 | |
Intramuscular injections or open muscle biopsy | |||
Surgical Tools | Scissors, Scapal, needle, surgical thread | ||
Vet Ointment | |||
Iodophors | webtextiles | 12190-71-5 | |
chlorohexidine | Peridex | 12134 | |
Surgical Drapes | |||
Srubs | |||
Facial Mask | |||
Surgical Gloves | |||
Head Covering | |||
Thiopental sodium | Mitsubishi Tanabe Pharma | 20 mg/kg | |
Isoflurane | Abbott laboratories | 05260-05 | 2-3% |
Antisense morpholinos | Gene-tools | Ex6A(GTTGATTGTCGGACCCAGC TCAGG), Ex6B(ACCTATGACTGTGGATGAG AGCGTT), Ex8A(CTTCCTGGATGGCTTCAAT GCTCAC) Dilute to a final volume of 100 L in opti-MEM media. 120–200 mg/kg of morpholinos at 32 mg/mL in saline |
|
27G Needles | TERUMO | SG3-2325 | |
50 mL syringe | TERUMO | SG2-03L2225 | |
buprenorphine hydrochloride | |||
Tougne Depressor | |||
cephalexin | 15 to 30 mg/kg | ||
cefazolin | 15 to 30 mg/kg | ||
buprenorphine | 0.01 mg/kg | ||
buprenorphine hydrochloride | 0.02 mg/kg | ||
Systemic Injections | |||
Syringe infusion pump | Muromachi | ||
22G Indwelling needles | TERUMO | SG3-2225 | |
27G Needles | TERUMO | SG3-2325 | |
50 mL syringe | TERUMO | SG2-03L2225 | |
Saline | Ohtsuka-Pharmaceutical | 28372 | |
Clinical Grading of Dogs | |||
Video Camera | |||
Stop watch | |||
Magnetic resonance imaging (MRI) | |||
3 Tesla MRI l | |||
18 cm diameter/18 cm length human extremity coi | |||
Muscle sampling and preparation (necropsy) | |||
Thiopental sodium | Mitsubishi Tanabe Pharma | 20 mg/kg | |
Isoflurane | Abbott laboratories | 05260-05 | 2-3% |
Tragacanth gum | 10-20 mL | ||
Liqoud Nitrogrn | |||
Cork Discs | Iwai-kagaku | 101412-806 | |
Dry Ice | |||
Tweezers | |||
Poly-l-lysine–coated slides | Fisher | 22-037-216 | |
Cryostat Microsystem | Leica | cm1900 | |
Immunohistochemistry | |||
DYS1 | Novocastra | NCL-DYS1 | 1:150 dilutions |
DYS2 | Novocastra | NCL-DYS2 | 1:150 dilutions |
Alexa 594 goat antimouse IgG1 | Invitrogen | A-21125 | 1:2,500 dilutions |
Alexa 594 goat antimouse IgG2 | Invitrogen | A-11005 | 1:2,500 dilutions |
DAPI | Invitrogen | D1306 | Contans mounting agent |
Goat Serum | Invitrogen | 10000C | 15% |
PBS | |||
Moisture chamber | Scientific Devise Laboratory | 197-BL | |
Chamber slide | Lab-tek | 154453 | |
Cover Glasses | Fisher | 12-540A | |
Hydrophobic barrier pen | |||
Flpurescent microcope | 594 nm at 20X magnification. | ||
Western Blotting | |||
Distillied Water | |||
Hand Homogenizer | |||
2× Laemmli SDS-loading buffer | 0.1 M Tris–HCl (pH 6.6), 2% (w/v) SDS, 2% (0.28 M) beta-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0.01% bromophenol blue | ||
SDS gels | Bio-Rad | 161-1210 | 5% resolving |
SDS gels | Invitrogen | Invitrogen, WG1601BOX | 3-8% |
PVDF membrane | GE | 10600021 | |
Methanol | |||
Transfer buffer (10×) | 250 mM of Tris-Base, 1,920 mM of Glycine | ||
Transfer buffer (1×) | 10% 10× buffer, 20% methanol | ||
0.05% PBS/Tween 20 (PBST) | 2,000 mL 3× 200 mL for washing |
||
PBST/5% milk powder | 100 mL | ||
Protein Assay Kit | BCA | T9650 | |
Tween 20 | Sigma | P5927 | |
Urea | Sigma | U5378 | |
Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
SDS | Sigma | L3771 | |
Tris-Acetate | Sigma | ||
Tris HCL | Sigma | T3253 | |
Glycerol | Sigma | G8773 | |
Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
NaCl | Sigma | S3014 | |
PMSF | Sigma | P7626 | |
Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
Cathode Buffer | .025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20 % Methanol | ||
desmin antibody | Abcam | ab8592 | |
DYS1 | Novocastra | NCL-DYS1 | 1:150 dilutions |
Image J Software |