To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.
Мы установили энтодермальную эпителиальной модель клеточной культуры (EEC) для изучения функции некоторых ферментов и белков в опосредовании использование пищевых веществ эмбрионов птиц в процессе разработки. Оплодотворенные Японские перепелиные яйца инкубировали при 37 ° С в течение 5 дней, а затем желток собирали мешка мембраны (YSM) установить ЕЭС систему культуры. Мы выделили эмбриональную энтодермы слой из YSM, и разрезали мембрану в 2 – 3 мм кусочки и частично переваривают коллагеназы перед посевом в 24-луночные культуральные планшеты. ОЦОД пролиферируют из ткани и готовы для проведения исследований на клеточных культурах. Мы обнаружили , что ОЦОД имели типичные характеристики YSM в естественных условиях, например, накопление липидных капель, экспрессия стерол O-ацилтрансферазы и липазы липопротеинов. Частичное лечение пищеварение значительно увеличило успешную ставку ЕЕС культуры. Используя EECS, мы показали, что экспрессия SOAT1 регулируется цАМФ гependent протеинкиназы связанный путь. Эта первичная японская система перепела ЕЕС культура является полезным инструментом для изучения эмбриональных липидный транспортировки и уточнить роль генов, участвующих в опосредовании использования питательных веществ в YSM во время эмбрионального развития птиц.
Основной питательный ресурс птичьего эмбриона желток, состоящий из 33% липидов, 17% белка, и 1% золы. 1 Во время эмбрионального развития желточный мешок мембрана (YSM) растет изнутри эмбриональном брюшной полости и постепенно охватывает желток поверхность. Начиная со 2 -й день эмбрионального, экспрессия генов , связанные с липидного обмена и ангиогенеза постепенно увеличивается в YSM и YSM развивается медленно ворсинок выступы. 8,9 Эти прогнозы увеличивают всасывание питательных веществ желтка для поддержки эмбрионального развития. YSM является внезародышевый ткани , которая содержит три зародышевых листка, энтодермы, мезодермы и эктодермы. 14 желточный мешок эктодерма лица белке и связи с желточной оболочки , чтобы мягко покрыть желтка. Энтодермальные эпителиальные клетки сталкиваются непосредственно к яичным желтком и служат в качестве питательных порталов утилизации. 6 По мере расширения YSM, энтодермальную эпителиальной клетки (EECS) можно разделить на Шапе и функциональность на две группы, площадь желточными и площадь vasculosa. 7
Площадь желточная состоит из клеток эндодермы и отстоит от эмбриона; Площадь vasculosa состоит из клеток мезодермы и охватывает дифференцированные EECS с кровеносных сосудов и соединительной ткани. Эмбриональным 5-й день, желток полностью покрыта эктодермы и энтодермы из YSM и сосудистый площадь быстро растет. YSM поглощает, recomposes и освобождает липиды (как желток происхождения липопротеинов очень низкой плотности) и белков в эмбриональном кровеносную систему. 9, 2 Таким образом, мы установили первичный японский перепел эмбриональных энтодермальную эпителиальной системы культивирования клеток, чтобы изучить механизмы липида использование в YSM во время эмбрионального развития птиц.
Липиды, такие как триацилглицерина, лецитина, фосфолипидов и эфиров холестерина (СЕ) являются основными источниками энергии для эмбрионов птиц. На ранних стадиях развития, желток липиды сomposed из всего лишь 1,3% CE и повышается до 10-15% в среднесрочной перспективе птичьего эмбрионального развития 3, 11 Сложный эфир холестерина. синтезируется из холестерина стерол O-ацилтрансферазы 1 (SOAT1) в области птичьего эмбриона YSM. 4
Форма хранения холестерина CE, CE осуществляется в липопротеинов и липопротеины транспортируется циркуляционной к тканям. 13 За неделю до люка происходит быстрый рост эмбрионов птиц. Примерно 68% из оставшихся содержание липидов в желтке всасываются во время этой стадии. 10 Механизм , посредством которого желток липиды используются могут быть уточнены с помощью ЕЕС исследовательской модели. Протокол культура курица ЕЕС была создана для достижения этой цели исследования. 2, 9 Тем не менее, из – за низкой вероятностью успеха эксплантов ткани усовершенствованную процедуру ЕЕС культивирования клеток необходима для изучения функции некоторых ферментов и белков в опосредовании использование питательных веществ путем эмбрионов птиц в процессе разработки.
Поскольку предыдущая система культура имеет лишь ограниченный успех, необходима лучшая система культуры. Японский перепел YSM эндодермы требует лечения протеолитических ферментов, таких как коллагеназы, чтобы ослабить межклеточных соединений для достижения более высокой производит?…
The authors have nothing to disclose.
Финансирование разработки текущего протокола, в частности, при поддержке "Цель для плана Top университет" Национального университета Тайваня, Тайвань (грант ID-104R350144), а также Министерства науки и технологий Тайваня (грант ID: НАИБОЛЕЕ 104 -2313-B-002-039-MY3). Мы особенно благодарим центр биотехнологии Национального университета Тайваня за предоставление комнаты животных и лабораторных помещений для текущего исследования.
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100ml | For attenuating the possible infection |
Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
24 well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
50 ML PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
50ML Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |