JoVE Journal > Neuroscience
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
自動翻訳
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
神経科学

הדמיה תלת-ממדית וניתוח של המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב Intraepidermal אנושי

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/53369
, , ,
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology,University of Michigan, 3内科学科,University of Michigan

概要

פרוטוקול זה משתמש תלת מימדי (3D) טכניקות הדמיה וניתוח כדי להמחיש ולכמת המיטוכונדריה עצבים ספציפיים. הטכניקות ישימות למצבים אחרים שם אות ניאון אחד משמש כדי לבודד ערכת משנה של נתונים מ עוד אות ניאון.

Abstract

המטרה של פרוטוקול זה היא ללמוד המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב intraepidermal. לכן, פותחו טכניקות הדמיה וניתוח 3D לבודד עצב ספציפיים המיטוכונדריה ולהעריך הנוצרות על-ידי מחלת שינויים של המיטוכונדריה בקצה הדיסטלי של העצבים החישה. הפרוטוקול משלב אימונוהיסטוכימיה פלורסצנטיות, מיקרוסקופיה קונפוקלית וטכניקות ניתוח תמונה תלת-ממדית כדי להמחיש ולכמת המיטוכונדריה עצבים ספציפיים. פרמטרים מפורטים מוגדרים לכל אורך ההליכים על מנת לספק דוגמה מוחשית כיצד להשתמש הטכניקות הללו כדי לבודד עצב ספציפיים המיטוכונדריה. נוגדנים שימשו כדי לתייג עצב, אותות מיטוכונדריאלי בתוך מקטעי רקמת העור אגרוף ביופסיות, אשר בעקבות immunofluorescence עקיף כדי להמחיש את העצבים ואת המיטוכונדריה עם אות ניאון אדום וירוק בהתאמה. Z-סדרת תמונות נרכשו עם מיקרוסקופיה קונפוקלית, נעשה שימוש בתוכנות ניתוח תלת-ממד כדי לעבד ולנתח את האותות. אין צורך לעקוב אחר הפרמטרים המדויק תיאר בתוך, אבל חשוב להיות עקביים עם אלה שנבחרו לאורך מכתים, צעדים analysis של רכישת. הכוח של פרוטוקול זה היא שזה ישים למגוון רחב של נסיבות שם אות ניאון אחד משמש כדי לבודד אחרים אותות שאחרת היה בלתי אפשרי ללמוד לבד.

Introduction

המיטוכונדריה לשרת פונקציות הסלולר חיוניים הכוללים הפקת אנרגיה בתא, מאגרי סידן, ועל ויסות נמק ו מוות תא מוות1,2,3. למערכת העצבים יש שיעור חילוף החומרים גבוה לעומת גוף4 רומז כי נוירונים לייצר רמה גבוהה של האנרגיה התאית בצורה של אדנוזין טריפוספט (ATP) דרך נשימה מיטוכונדריאלי. הרבה מסמכים ראיות כי פונקציות עצביים תלויות ב- ATP5, במיוחד בזמן הסינפסות6. לכן, ההתפלגות של המיטוכונדריה בתוך הנוירונים הוא חשוב.

במהלך 10 השנים האחרונות שהרבה מידע הראה ש של סחר בבני אדם, עגינה של המיטוכונדריה עצביים מאוד מווסתות. מנוע חלבונים מעורבים הפצת המיטוכונדריה כדי ספציפי תאים סלולריים לאורך הנוירון. סחר בבני אדם של המיטוכונדריה חשוב במיוחד כי נוירונים פרויקט אקסונים ו דנדריטים הרחק מן סומא. קינזין מנוע חלבונים בעיקר לכוון anterograde (הרחק סומה) סחר של המיטוכונדריה לאורך microtubules תוך דינאין חלבונים מנוע ישיר תנועתיות רטרוגרדי (לכיוון סומה)7,8,9 , 10. שם הן אותות תאיים כזה מיטוכונדריאלי קרומית אפשרית הולכה דחף המשפיעים על נוכחות והכיוון של מיטוכונדריאלי סחר11,12,13.

בנוסף לשינוע המיטוכונדריה, ישנם חלבונים מיוחדים כדי להתאים לשפה המיטוכונדריה כדי תאים הסלולר ספציפיים שיש להם דרישות אנרגיה גבוהה, כגון Ranvier של צמתים, הסינפסות8,14, 17. למעשה, הרוב המכריע של המיטוכונדריה בתוך אקסונים הם שאינם תאי9,13,18. חלבונים מיוחדים כמו syntaphilin המיטוכונדריה עוגן כדי microtubules לאורך אקסונים בזמן לחלבונים אחרים עיגון המיטוכונדריה אקטין שלד התא19–21. גורמי גדילה, יונים כגון סידן דווחו לתמוך הפסקת תנועת המיטוכונדריה למקם אותם לאזורים איפה הם הצורך21,22,23.

יחדיו, סחר עגינה של המיטוכונדריה הם חיוניים לתפקוד תקין של נוירונים. כדי לתמוך בזה, הפרעה סחר מיטוכונדריאלי היה קשור עם מספר מחלות נוירולוגיות כולל מחלת אלצהיימר, נוירודגנרטיביות, שארקו-מארי-טות ‘, מחלת הנטינגטון, עוויתי תורשתי paraparesis, ניוון אופטיים15,24,25,26,27. המחקרים האחרונים התמקדו בתפקוד מיטוכונדריאלי, פתולוגיה כמנגנון פוטנציאליים עבור נוירופתיה סוכרתית, אובדן חושים הקשורים לסוכרת28,29,30,31 32, ,33. ההשערה היא כי סוכרת הפיצולים ההתפלגות של המיטוכונדריה בתוך ההשתקפויות חושית של ותאי העצב עורית. לכן, הטכניקה פותחה כדי להמחיש ולכמת המיטוכונדריה בתוך סיבי העצב intraepidermal (IENFs), קצות דיסטלי שורש העזוב גנגליון afferents חושית. הטכניקה משלב פלורסצנטיות אימונוהיסטוכימיה של ספציפי מיטוכונדריאלי ותוויות סיבי עצב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית רכישת מסדרת z של אותות עם תוכנת ניתוח תמונה תלת-ממדית חזק כדי למדוד את ההתפלגות של עצבים ספציפיים המיטוכונדריה מן האדם עורית אגרוף ביופסיות להשגת מטרה זו.

Protocol

נושאים גויסו מרשת טיפול ראשוני בקהילה גדולה במרכז לסוכרת אוניברסיטת יוטה (סולט לייק סיטי, יוטה), ביופסיות ניקוב עור התקבלו. מחקר זה היה אושרו על ידי ועדת הבדיקה מוסדיים באוניברסיטת מישיגן, פעלו לפי עקרונות הצהרת הלסינקי. נכתב מדעת היה המתקבלים לכל נושא לפני בדיקות. 1. קרינה פ?…

Representative Results

ויזואליזציה, כימות של המיטוכונדריה בתוך IENFs אנושי קרינה פלואורסצנטית אימונוהיסטוכימיה מאפשר תיוג סימולטני של אותות מרובים בתוך ביופסיות העור האנושי לדמיין העצבים המיטוכונדריה, גרעינים. צלחת 96-ובכן הוא דרך נוחה כדי לארגן את השל…

Discussion

פרוטוקול זה תוכנן כדי לבודד, לכמת ולנתח את גודל ואת ההפצה של המיטוכונדריה עצבים ספציפיים בתוך IENFs תלת-ממד של ביופסיות העור האנושי. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. אימונוהיסטוכימיה פלורסצנטיות לתרשים נועד להכתים וניתוח אותות מרובים בכל מדגם, מתן מתודולוגיה תכליתיות עבור מחקר לקטעים<sup c…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מוסדות של בריאות מענקים K08 NS061039-01A2, תוכנית למחקר נוירולוגיה & גילוי, א אלפרד טאובמן רפואי מכון המחקר של אוניברסיטת מישיגן. עבודה זו נעשה שימוש של מורפולוגיה הליבה ניתוח תמונה של מרכז מחקר סוכרת מישיגן, הממומן על ידי מוסדות לאומיים של בריאות גרנט 90 P 5 DK-20572 במכון הלאומי של סוכרת, העיכול, מחלות כליה. המחברים רוצה להודות ג’י רובינסון סינגלטון ו א גורדון סמית ‘ (אוניברסיטת יוטה) לתרומה הנדיבה שלהם של דגימות העור האנושי.

Materials

2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1X PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA		 MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
  2. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
  3. Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
  4. Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
  5. Ames, A. CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
  6. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
  7. Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
  8. Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
  9. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
  10. Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
  11. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754 (2013).
  12. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
  13. Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
  14. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
  15. Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
  16. Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
  17. Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
  18. Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
  19. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  21. Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
  22. Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
  23. Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
  24. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  25. Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
  26. Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
  27. Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
  28. Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
  29. Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
  30. Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
  31. Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
  32. Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
  33. Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
  34. Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  35. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  36. Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
  37. Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
  38. Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
  39. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
  40. Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. 神経科学. 238, 258-269 (2013).
  41. Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
  42. Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
  43. Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
  44. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  45. Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
  46. Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
  47. Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
  48. Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  49. Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
  50. Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).

タグ

3D ImagingMitochondriaIntraepidermal Nerve FibersFluorescence ImmunohistochemistryPGP9.5PDHSecondary AntibodiesSignal EnhancementEpidermal Nerve FibersNeurological Complications

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, E. L., Lentz, S. I. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (127), e53369, doi:10.3791/53369 (2017).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image