Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.
A tuberculose (TB) ainda mantém uma grande ameaça para a saúde das pessoas em todo o mundo, e há uma necessidade de modelos de custo-eficiente, mas de confiança para nos ajudar a compreender os mecanismos da doença e avançar as descobertas de novas opções de tratamento. Culturas celulares in vitro de monocamadas ou co-culturas falta o ambiente tridimensional (3D) e as respostas dos tecidos. Descrevemos um inovador modelo in vitro de um tecido de pulmão humano, o que é uma promessa para ser uma ferramenta eficaz para o estudo dos complexos eventos que ocorrem durante a infecção com Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). O modelo de tecido 3D consiste em células epiteliais e fibroblastos específicos de tecido, que são cultivadas numa matriz de colagénio no topo de uma membrana porosa. Após a exposição ao ar, as células epiteliais estratificar e secretam muco no lado apical. Com a introdução de macrófagos primários humanos infectados com M. tuberculose para o modo de tecidol, que têm demonstrado que as células imunes migram para o tecido infectado e formar fases iniciais de granuloma TB. Estas estruturas recapitular a característica distinta da tuberculose humana, o granuloma, que é fundamentalmente diferente ou não comummente observadas em modelos animais experimentais utilizados. Este método de cultura organotípicas permite a visualização 3D e análise quantitativa robusta que fornece informação fundamental sobre as características espaciais e temporais de interações celulares patógeno-hospedeiro. Tomados em conjunto, o modelo de tecido de pulmão proporciona um micro-ambiente fisiologicamente relevante tecidos para estudos sobre a tuberculose. Assim, o modelo de tecido pulmonar tem implicações potenciais para ambos os estudos mecanicistas e aplicadas básicas. Mais importante, o modelo permite a adição ou a manipulação de tipos de células individuais, que, assim, alarga o seu uso para modelar uma variedade de doenças infecciosas que afectam os pulmões.
Nos seres humanos, as respostas à infecção, inflamação do tecido, recrutamento celular, remodelamento tecidual e regulação da homeostase do tecido são eventos complexos que envolvem diferentes tipos de células. Assim, estes processos são melhor estudada no ambiente de tecido local. Anteriormente, esta tem sido possível principalmente em modelos animais experimentais. No entanto, os animais experimentais utilizados conter muitos limites como respondem frequentemente de agentes patogénicos de um modo diferente do que os seres humanos e também exibir um curso diferente da doença 1. Um modelo humano in vitro tecido pulmonar mantém a possibilidade de estudar as respostas imunitárias específicas do pulmão humano.
Infecção por tuberculose humana (TB) é uma doença que afecta principalmente os pulmões. Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), o agente causador da tuberculose, atinge o pulmão através de gotículas de aerossol que são transportadas para o espaço alveolar, onde as bactérias são engolidos por dendri pulmonarcélulas de tiques e macrófagos alveolares como parte da resposta imune inata a infecção 2,3. Fagocitose do patógeno leva à compartimentação do bug dentro de um phagosome e, idealmente, resulta na neutralização e assassinato do patógeno pelo fagócitos. Até 50% de indivíduos expostos a M. tuberculose são acreditados para ser capaz de eliminar a infecção por meio da resposta imune inata 4. Outros resultados de infecção são apuramento pelo sistema imunológico adaptativo, numa fase posterior, a infecção latente ou no pior dos casos doença crónica activa 5.
Anteriormente, não houve modelos in vitro de tecidos para estudos de tuberculose humana. Culturas de células individuais de macrófagos humanos ou outras células de sangue periférico foram frequentemente utilizados 6,7. A desvantagem desta abordagem é que eles não podem reflectir a dinâmica de diferentes tipos de células que operam em conjunto num tecido pulmonar exposto a M. tuberculose </em>. Assim, existe uma necessidade para um modelo in vitro para ser capaz de realizar estudos funcionais e mecanísticos sobre a tuberculose. O modelo in vitro de tecido de pulmão humano aqui descrita com base nas células foi originalmente criada pelo nosso grupo de estudos sobre as funções das células dendríticas 8. Temos adaptado este método para o estudo dos TB.
O modelo de tecido de pulmão humano aqui apresentada é constituída por células epiteliais e fibroblastos 8 específicos de tecidos. Estas células são cultivadas numa matriz de colagénio no topo de uma membrana porosa Transwell em uma inserção de estruturas e formas semelhantes tecido de pulmão humano normal (Figura 1). Quando exposto ao ar as células começam a segregar muco no lado apical 8. Através da implantação de macrófagos primários humanos infectados com M. tuberculose com o modelo, observou-se a forma como as células do sistema imunológico migrar no tecido e formam fases iniciais de granulomas 9 TB. Este é o primeiro modelo de tecido humano described para TB e representa uma ferramenta promissora para o estudo da resposta imune inata a TB e outras doenças do pulmão. Até à data, utilizou-se apenas monócitos e macrófagos como células do sistema imunológico no modelo, mas o nível de complexidade pode ser aumentada por inclusão de tipos de células relevantes adicionais.
Figura 1. Diagrama esquemático do contorno modelo de tecido de pulmão. (A) O modelo é composto de células epiteliais pulmonares humanas específicas do, M. tuberculose infectados com macrófagos primários e corante vermelho monócitos marcados semeados em colágeno incorporado fibroblastos preparado com um filtro transwell. Exposição do modelo de tecido de ar inicia a produção de proteínas da matriz extra-celular, a secreção de muco e estratificação pelo epitélio. O modelo de tecido 3D assim desenvolvido é uma ferramenta útil para estudar M. infecção por tuberculose em um ambiente que closely se assemelha a um pulmão humano. (B) imagens microscópicas representativas das diferentes etapas na preparação do modelo de tecido. (C) estrutura completa da secção de tecido do modelo de pulmão. Scale -. 100 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
The ability to recruit and form organized cell clusters at the site of infection is the hallmark of human TB 11. These dynamic structures known as tubercle granulomas primarily consist of immune cells (macrophages, monocytes, T-cells and B-cells) and multi-nucleated giant cells surrounding M. tuberculosis. The role of the granuloma has long been considered to wall off the infection, preventing local spread of bacteria. However, more recent studies show that granuloma formation is critical for early bacterial survival, growth and dissemination 12. A strategy of new studies is to identify molecules or pathways that could efficiently be targeted to inhibit the cellular migration in granuloma formation and/or TB dissemination.
A caveat for novel studies on TB is the lack of models that recapitulate human TB. The most widely used experimental animals do not form true granuloma upon M. tuberculosis infection, and are therefore not appropriate choices for studies of TB 13-16. Non-human primates have the closest resemblance to human TB 17, but are not the preferred choice owing to high operational costs and ethical issues. Human TB is a complex immunological process and is difficult to model in vitro. Cell cultures of monolayers or co-cultures lack the 3D environment and tissue responses. Therefore, we have developed an innovative lung tissue model based on human primary immune cells and human lung-specific cell lines 8,9. The model displays characteristic features of human lung tissue, including epithelia with evenly integrated macrophages, formation of extracellular matrix, stratified epithelia and mucus secretion 9.
The 3D human lung tissue model has several benefits over the in vitro single or co-cultures seeded on tissue culture plates or transwell inserts. First, the human lung-specific cells (fibroblasts and epithelial cells) are not commonly included in the in vitro single or co-cultures. Second, the immune cells and lung-specific cells are embedded in a 3D physiological context (collagen rich extra-cellular matrix products). The response of cells to a stimulus/infection and the migratory behaviour of cells, for instance formation of a granuloma, differ significantly between a 2D and 3D environment. Furthermore, the described method enables the 3D visualization and robust 3D quantitative analysis that provides pivotal information on spatial distribution and intricate cellular interactions.
Experimental infection in the model tissue with M. tuberculosis resulted in clustering of macrophages at the site of infection, reminiscent of early TB granuloma (Figure 2 and 3). We have recently demonstrated that mutant strains defective in the ability to secrete the virulence factor ESAT-6 or Mycobacterium bovis BCG that lacks ESAT-6 did not induce the clustering of monocytes (no early granuloma), in contrast to the virulent M. tuberculosis 9. These data are consistent with the observations made from Mycobacterium marinum-infected zebrafish embryos, whose transparency allows for elegant live imaging of granuloma formation 12. As there is no gold-standard model for TB, we took advantage of the surgically resected tissue biopsies from TB patients for validation of the method 9. Our in vitro tissue model shares several characteristics with the lung and lymph node biopsies from TB patients, including the aggregation of macrophages in granuloma, the presence of both intra- and extracellular bacteria 18 and induction of necrosis 11.
Although the described model has physiological relevance to human TB and has several advantages over other in vitro models, it has some limitations. For instance, out of more than 20 collagen proteins identified in humans, only type I is included to the model to mimic the extra-cellular matrix. However, type I collagen is a complex mixture of extra-cellular matrix products and is the most abundant collagen in the human body. Further, we have demonstrated the presence of collagen IV and several extra-cellular matrix proteins such as tropoelastin, vimentin and laminin, which are produced by the epithelial cells and fibroblasts in the tissue model, indicating the synthesis of new collagen 8. Presently, the lung tissue model only has monocytes and macrophages, besides lung-specific cells. It lacks neutrophils and lymphocytes that are also known to be present in the granuloma. Remarkably the model is not limited to the introduction of additional immune cells and is of interest to explore how they contribute to the complex cellular interactions in human TB. Implantation of primary alveolar macrophages, skin-specific cells and lung carcinoma cells has already been tested in the model. Since our objective was to use a model that closely resembles human TB, introduction of mouse cells have not been attempted.
In summary, the lung tissue model has implications for both basic mechanistic and applied studies. Potential applications of the lung model include the study of innate immunity, investigating mechanistic aspects of host defences such as phagosomal maturation, autophagy, production of cytokines, chemokines and anti-microbial peptides, and functional characterization of individual cell types. Strikingly, the in vitro tissue model allows manipulation of one or more cells types and provides a relevant tissue micro-environment, not only for studies on TB, but for a variety of infectious and non-infectious diseases that affect the lungs.
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge the Microscopy core facility at the Faculty of Health Sciences, Linköping University for providing access to advanced imaging systems; Karl-Eric Magnusson (Emeritus Scientist) at the Dept. of Clinical and Experimental Medicine, Linköping University for providing access to Imaris 3D/4D image processing software (Bitplane, Switzerland); and S. Braian for his help with the lung model cartoon. This work was supported by funds from the Swedish Research Council (Alternatives to animal research, 2012-1951) and Swedish Research Council (2012-3349) to M.L. and Swedish Foundation for Strategic Research to S.B. S.B. receive grants from the Karolinska Institutet, Swedish Research Council, the Swedish International Development Cooperation Agency (Sida) and the Swedish Civil Contingencies Agency (MSB), and the Swedish Heart and Lung Foundation (HLF). M.S. received grants from the Karolinska Institutet and Stockholm County Council.
Cell culture inserts | BD Falcon | 353092 | |
6-well culture plates | BD Falcon | 353046 | |
MRC-5 cells, lung fibroblasts | ATCC#CCL-171 | ||
16HBE cells, lung epithelial cells | Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA | ||
5 x Dulbecco’s modified Eagle’s medium (5 x DMEM) | Gibco | 12800-082 | Made from powder but add 5 times less water. Adjust pH to 7.3 and filter it using a 0.2 µm filter. |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium with glucose (DMEM) 1x | Gibco | 41965-039 | |
Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle’s salts | Sigma | M4655 | |
Non-Essential Amino Acids Solution, 100x | Life Technologies | 11140-035 | |
L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-024 | |
Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
NaHCO3 (71.2 mg/ml) | Prepared in house | ||
Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Heat inactivated for 30 min, 56 °C |
Gentamicin (50 mg/ml) | Gibco | 15750-060 | |
Hepes buffer solution 1M | Gibco | 15630-056 | |
Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco | 15140-122 | |
Lymphoprep | Axis-Shield | 7801 | |
Ultrapure 0.5 M EDTA | Gibco | 15575 | |
Bovine Collagen PA treated (500 ml) | Organogenesis | 200-055 | |
Pure col purified Bovine Collagen solution (100 ml) | Advanced biomatrix | 5005-B | |
Extracellular matrix protein, Fibronectin (1 mg) | BD | 354008 | |
Primary human monocytes/macrophages | Isolated from human whole blood or buffy coats. | ||
PKH26 Red fluorescent cell linker | Sigma | MINI26 | |
Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressing green fluorescent protein | M. tuberculosis H37Rv wild type was transformed with the pFPV2 plasmid constitutively expressing GFP. | ||
Middlebrook 7H9 medium | Difco | 271310 | |
BBL Middlebrook ADC Enrichment | BBL | 211887 | |
Tween-80 | |||
Glycerol | |||
Kanamycin B sulfate (20 µg/ml) | Sigma | B5264 | |
Prolong Gold anti=-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
Trypsin -EDTA | |||
Bovine serum albumin | |||
Paraformaldehyde | |||
DAPI | |||
LSM700 Confocal microscope | Zeiss | ||
iMaris Scientific 3D/4D image processing software, version 7.6.8 | Bitplane AG |