Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.
The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold.
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.
Massive défauts osseux diaphysaires sont un grand défi pour le chirurgien orthopédiste. remplacement d'os avec greffe osseuse autologue, actuellement considéré comme le traitement de l'étalon-or, est en quantité limitée et est associée à une morbidité liées à la récolte. Pour toutes ces raisons, les constructions osseuses de l'ingénierie tissulaire combinant des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse avec échafauds ostéoconducteur ont été explorés comme une alternative pour les autogreffes dans la chirurgie orthopédique.
À ce jour, la plupart des études ont été réalisées dans des modèles animaux cliniquement pertinents , tels que les chiens, les porcs et les moutons 1-3, mais l' évaluation préliminaire de ces constructions dans orthotopique, segmentaire, critique de taille os défauts dans les modèles de petits animaux (comme souris) pourrait avoir plusieurs avantages: (i) de faibles charges, (ii) un grand nombre d'animaux peuvent être utilisés; (Iii) contrairement aux grands modèles animaux, l'homogénéité des souches de souris limite les variations individuelles de la résorption d'un échafaudagee formation de l'os et; (Iv) le plus important, la disponibilité d'anticorps spécifiques et les animaux de gènes ciblés permettre l'évaluation des processus biologiques impliqués dans la cicatrisation osseuse. Last but not least, l'utilisation de souches immunodéficientes de souris permet également des études en utilisant soit des greffes ou des cellules d'origine humaine sans réponses immunitaires indésirables chez les souris.
Malgré les avantages mentionnés ci-dessus, les modèles de défauts osseux diaphysaires massives chez la souris sont rares. La plupart de ces modèles utilisent fixation d'os d'une broche intramédullaire qui remplit la cavité de la moelle osseuse (limitant ainsi le volume du matériau à tester) et empêche également la reproductibilité en ne fournissant pas la stabilité en rotation et axial 2,4-7.
Les objectifs de l'étude sont (i) mimant une situation de non-union osseuse clinique, pour décrire un, critique de taille reproductible, segmentaire, modèle de défaut fémorale chez la souris, qui est stabilisée par précis et reproductible blocage plaque osteosynthesis qui fournit un environnement biomécanique très stable 8-10; (Ii) pour illustrer le présent modèle avec deux substituts osseux potentiels et de décrire les analyses formation d'os qui pourraient être utilisés.
Implantation ectopique de matériaux et dispositif chez des souris orthopédiques liées est généralement effectuée pour évaluer l'os formant des capacités des diverses échafauds 13,14. Des différences importantes existent cependant entre les modèles ectopiques et orthotopique, y compris les facteurs de signalisation ostéogénique indigènes et les interactions paracrines avec les cellules osseuses formant hôtes.
La présente étude établit un reproductible grand segmentaire murin, critique taille défaut fémoral (3,5 mm, environ 20-25% de la longueur du fémur). Compte tenu de la taille d'un tel défaut et la stabilité fournie par la plaque ostéosynthèse résultante, ce modèle imite l'os atrophique non-union cliniquement rencontré.
La période post-opératoire choisi dans la présente étude, est en ligne avec les souris modèles non syndiqués décrits précédemment, montrant un manque de guérison adéquate après 8 à 12 semaines 4,9,15,16.
Plus important encore, reproduet stable ostéosynthèse cible, ainsi que la stabilité des substituts osseux implantés ont été obtenus sans morbidité et une mortalité de 1,2 à l'utilisation à la fois la plaque de verrouillage et un dispositif de serrage pour effectuer l'ostéotomie. Ce résultat contraste également les résultats rapportés lorsque l'un fixateur externe ou d' un clou intramédullaire ont été utilisés 4,5,17-24. Pour les fixateurs externes inconvénients potentiels comprennent: la variabilité de la rigidité, les infections des voies broches, desserrant des broches, des potentiels de blessures dues aux broches et le poids des matériaux (4 à 20% du poids du corps de la souris). Pour le clou intramédullaire inconvénients potentiels incluent: le remplissage de la cavité médullaire avec l'ongle et des lésions iatrogènes des surfaces articulaires.
D' autres segments de souris, la taille critique des défauts fémorale stabilisée par une plaque d' ostéosynthèse ont été décrits par défaut osseux créé par une bavure et allant de 1,5 à 2 mm de long 16,25. In the modèle actuel, l'utilisation d'un gabarit et un fil de scie a permis une précision de 3,5 mm de long ostectomie sans muscles importants traumatismes.
Cependant, pour réussir dans l'accomplissement de la procédure il faut prendre en considération plusieurs points clés: Ne pas utiliser petite souris (souris Nude soit avec un poids de moins de 25 g ou de l'âge de moins de 8 semaines), sinon la plaque devrait être trop long. Lorsque vous approchez de l'os fémoral, prendre soin de préserver à la fois le nerf sciatique caudale et la capsule articulaire distale. Appliquer la plaque sur le côté antérieur de l'os fémoral et depuis l'alignement de la plaque est déterminée par application de cette première vis, prendre soin de positionner la plaque parallèle au fémur lors de l'insertion de cette première vis.
Avant de faire le ostectomie, prendre soin d'effectuer une dissection circulaire du fémur au milieu de la diaphyse pour éviter un traumatisme musculaire. Lors de l'exécution de la ostectomie, l'assistant du chirurgien doit tenir fermement le guide et le surgeon doit être prudent (i) de ne pas emmêler le fil de scie, (ii) d'utiliser les moyens des deux tiers du fil tout en appliquant une tension constante et régulière, et (iii) afin d'éviter un mouvement excessif pour obtenir une coupe osseuse droite.
la cicatrisation osseuse est possible dans le présent modèle pourvu d'une greffe osseuse est utilisée. En outre, ce modèle permet d'autres études sur les mécanismes impliqués dans les stratégies de remplacement des os lorsque soit des greffes d'origine humaine ou des cellules sont utilisées dans un grand, segmentaire, défaut osseux bien standardisé.
En outre, conformément aux tendances actuelles exigeant le raffinement et la réduction de l' utilisation des animaux dans la recherche liée à l' orthopédie, ce modèle peut être utilisé en conjonction avec des techniques d'imagerie in vivo telles que la bioluminescence. Ces techniques non invasives permettent de suivre à la fois la survie des cellules implantées et la guérison des tissus sans exiger le sacrifice d'animaux 26.
Les principales limites du modèle actuel sont à la foisles conditions portantes et le volume du défaut osseux créé, car ils ne miment pas complètement celles rencontrées cliniquement chez les humains. Autres limites du modèle sont (i) la radio-opacité de la plaque qui peut nécessiter l' enlèvement de la plaque avant ex vivo μCT analyse et peut compliquer l' interprétation des résultats longitudinaux d'examen radiographique et, (ii) l'incapacité de moduler la rigidité de plaque peut être un paramètre clé mécanique dans la formation osseuse 27-30.
Il faut garder à l'esprit également, lors de l'utilisation soit isogreffe osseuse ou d'autres échafauds contenant un composant minéral (en particulier le carbonate de calcium), que certains biais sont introduits dans le processus de segmentation de l'analyse micro-CT, parce que la densité osseuse nouvellement formée en partie recouverte par soit la densité de isogreffe ou de la densité de l'échafaudage. Pour cette raison, le volume osseux obtenir par l'analyse micro-CT refléter principalement le volume des tissus minéralisés (os nouvellement formé, plussubstitut osseux) 11,26,31.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier Rena Bizios pour ses précieux commentaires sur le manuscrit.
α-MEM , Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich, France | M4526 | 500 ml |
Acropora sp. coral exoskeleton cubes, Biocoral® | Biocoral®, Inoteb, France | 3x3x3 mm cubes, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization | |
Buprenorphine, Buprecare® | Axience, Pantin, France | 0.3 mg/ml | |
Xylazine, Rompun® 2% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 20 mg/ml | |
Ketamine, Ketamine 500® | Virbac, Carros, France | 50 mg/ml | |
Isoflurane, Forène® | Abbott, Arcueil, France | ||
Enrofloxacine, Baytril® 5% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 50 mg/ml | |
Pentobarbital, Dolethal® | Vétoquinol, Lure, France | 182,2 mg/ml | |
Anesthetizing box | Ugo Basile, Gemonio, Italy | 7900/10 | |
Plastic transparent sterile drape, BusterOpCover 30*45cm | Buster, Coveto, Montagu, France | 613867 | |
10% povidone iodine, Vétédine® Solution | Vétoquinol, Lure, France | 100 mg/ml | |
Titanium micro- locking plate, MouseFix Plate XL | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.120 | 6 holes, 10 mm long and 1.5 mm wide, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.3 mm drill bit, Drill Bit 0.30 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.592.200 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Engine power | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | AccuPen | Cold sterilzation (ethylene oxide) |
Screw driver, Handrill | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.390.130 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Self-tapping locking screws, MouseFix Screw 2 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.100 | 2 mm long, 0.47 mm outer diameter and 0.34 mm core diameter, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Jig,MouseFix XL Drill and Saw Guide | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.301.103 | 3.5 mm between the slots, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.22-mm Gigli saws (0.22 mm Saws) | RISystem AG, Davos, Switzerland | ||
5.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
4.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
Xray, MX20 | Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie | ||
in vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1176 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Ex vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1172 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Resident software: Nrecon(v1.6.9)/Ctan(v.1.14.4) | Skyscan, Aartselaar, Belgium |