Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.
셀의 미세 구조의 묘사는 그 기능을 이해하는 것이 중요하다. 여기에는 장 상피의 장 내분비 세포 등 다양한 세포 유형, 만들어진 조직 전반에 걸쳐 확산 드문 세포 유형에 대한 발굴 프로젝트가 될 수 있습니다. 1000 : 그들은 1의 비율로 다른 상피 세포 사이에 분산되어 있기 때문에 음식과 세균이 위장 센서 공부하기 어려운되었습니다. 최근, 트랜스 제닉 리포터 생쥐 형광 의해 장 내분비 세포를 식별하기 위해 생성되었다. 그 중 하나는 펩티드 YY-GFP 마우스이다. 이 마우스를 사용하여, 우리는 촛점과 직렬 블록면을 주 사형 전자 현미경을 상관하는 방법을 개발 하였다. 우리는 방법 cocem3D 이름과 조직의 특정 장 내분비 세포를 식별하고 3D로 세포의 미세 구조를 공개하는 데 적용. cocem3D의 해상도 볼륨 RE에서 세포막을 분비 소낭 작게 소기관를 식별하고 구별하기에 충분ndering. Cocem3D 쉽게 그 나라의 특정 조직에서 다른 세포 유형의 3 차원 미세 구조를 연구하기 위해 적응 될 수있다.
세포 내 인생은 시간과 공간에서 일어난다. 경시 변화는 종종 초해 현미경 같은 형광 이미징 기술과 결합 경과 현미경을 사용하여 연구된다. 공간은, 세포 또는 세포 간 상호 작용 내부 소기관의 배열, 특히, 단지 셀의 미세 구조의 전체 계좌에 의해 유도 될 수있다. 셀의 미세 구조의 광범위한 계정은 C. 같은 유전체를 사용할 경우에 게놈 기능 선명 해 엘레 선충 1 평면 placozoa의 tricoplax는 2 adherens. 직렬 단면 전자 현미경 해주기 효율적인 재현성, 시간 및 직렬 블록면을 주 사형 전자 현미경 (3) (SBEM) 같은 자동화 된 3 차원 전자 현미경 기술의 개발, 덜 비싼 태스크 덕분이다.
기능을 규명하는 구조 정보의 필요성은 특정 CEL 매우 분명하다이러한 뉴런, 아교 세포, 또는 감각 상피 세포와 같은 기능이 물리적 세포 간 상호 작용에 따라 L 타입. 우리는 창자의 루멘의 영양소에서 감각 신호가 궁극적으로 appetitive 행동을 조절하는 전기 신호로 형질 도입하는 방법을 아는데 특히 관심이 있습니다. 회로는 복잡하지만 영양분 감각 상피 세포라는 장 내분비 세포와 접촉 여기서 소장의 벽에서 시작한다. 이러한 미각 세포 등의 다른 감각 상피 세포와 달리, 장 내분비 세포는 천 4-7 하나의 비로 창자 상피 전반에 걸쳐 분산된다. 결과적으로, 그들은 식별하고 연구하기 어려웠으며, 오랜 시간 동안 그들은 단지 소화관 호르몬의 소스로 간주 하였다. 그러나 셀 고유 형광 리포터 생쥐의 발달이 세포의 복잡한 감각 기능이 등장하고있다. 이 기자 마우스 중 하나, 펩티드 YY-GFP (PyyGFP) 마우스를 사용하여, 우리는 그 enteroendocr 발견오프라인 세포는 우리가 neuropod라는 저명한 세포질 꼬리를 가지고있다. neuropods의 외관은 세포 간 통신에 보존 된 기능을 제시 하였다. 그러므로, 우리는 장 내분비 세포의 미세 구조를 문서화하여 neuropods의 함수가 유도 될 수 있음을 추론했다.
식별하기 어려운 분산 셀 부속물의 구조를 이해하기 위해 필요 공 초점 현미경과 SBEM을 결합하는 방법을 개발하기위한 주된 이론적 근거이다. 관심 셀 PyyGFP 장 내분비 세포 특이 리포터 생쥐를 이용하여 확인 하였다. 이 방법은 우리가 장 내분비 세포와 neuropod의 전체 미세 구조를 문서화하는 것을 허용했다. neuropods 내에서, 우리는 신경 세포의 축색 돌기의 구조적 특징을 발견하고, neuropods 외부, 우리는 장 아교 세포 (8)에 대한 물리적 관계를 발견했다. 실제로, neuropods 이러한 세포의 분비 기능에 필수적인 역할을 제안 모든 분비 소포의 약 70 %가 포함되어 있습니다. 에 구축구조적 데이터는보다 최근 우리는 이러한 neuropods 통해서, 장 내분비 세포와 뉴런 직감 혀의 미각 8,9 세포의 것과 유사한 neuroepithelial 회로를 형성 지배하는 것을 발견했다.
구조적 데이터에서 비롯 위장 화학 감각 메커니즘 등의 기능을 폭로하는 것은이 상호 현미경 방법을 사용하여 모였다. 우리는이 방법은 세포가 매우 낮은 비율로 조직 내에서 분산 특히 세포 생물학의 다른 분야에서 유용하게 사용될 수 있으리라 생각합니다. 우리는 3D (Cocem3D)에 상관 공 초점 및 직렬 블록 얼굴 스캐닝 전자 현미경 등의 방법이라고. 방법은 다음과 같은 주요 단계로 구성되어 조직의 절개, 공 초점 현미경, SBEM 영상, SBEM 및 공 초점 이미지의 상관 관계 및 수동 분할을. 상관이 아닌 물리 화학적 상호 때문에 다른 방법에 비해, 개념은 비교적 간단하다.
위장 chemosensation는 생물 의학 연구에서 흥미로운 새로운 분야로 부상하고있다. 이는 장 내분비 세포 (18)의 기능적 미각 수용체의 발견으로 큰 부분이다. 후속 연구는 장 내분비 세포가 탄수화물, 지질 및 아미노산 5,6,19,20를 포함하여 영양소, 특정 수용체를 발현하는 것으로 나타났습니다. 이러한 발견을위한 촉매 요소는 장 내분비 세포가 형광 물질 (20)로 표시되는 리포터 마우스의 개발이었다. 우리는 원위부 소장과 대장 17,21의 장 내분비 세포를 연구하기 위해,이 마우스 하나, PyyGFP 마우스를 개발했다. 그들은 물림 22,23 유도제이다 둘 PYY 및 글루카곤 유사 펩티드 1 분비 때문에 이러한 세포는 관심이다. 당시,이 세포의 전체 초 구조 계정은 우리가 그들의 신호 메커니즘을 이해하는 것이 필수적 생각하는, 누락되었습니다.
"ontent은> 여기에서, 우리는 SBEM와 공 초점 현미경을 해소하기 위해 시각적 방법을 설명했다. 방법은 우리가 장 내분비 세포의 전체 미세 구조를 문서화 할 수 있습니다. 우리는이 세포가 3 ~ 포함 neuropod이보고 한 허용 Cocem3D로 불린다 세포를 장 내분비이 neuropods 물리적 뉴런에 연결하지만 분비 소포 8의 모든 분기. neuropod 내에서이 neurofilaments 및 신경 축삭 같은 많은있다, neuropods이 장 신경 교세포 (8)에 의해 양육된다. 더 중요한 것은이 장을 지배하는과 콜론 9.cocem3D의 장점 중 하나는 단순하다. 공 초점에 의해 촬영하고 SBEM은 조직 내의 특정 셀의 식별을 용이하게 할 수있는 블록에 조직 샘플을 감소시킨다. 분비 소낭 및 다른 소기관 7 ㎚ / 화소의 해상도를 용이하게 식별 될 수있다. SBEM의 섹션이 폐기되기 때문에, 추가로 사전 처리특정 단백질을 식별하기 위해 조직의 노래하는 것은이 시점에서 옵션을 선택하지 않습니다. 그러나, 조직 블록으로부터 부분이 보존되는 아툼 (24) 등의 방법의 개발, 셀 내의 특정 단백질의 식별을 가능하게 할 가능성이있다. 장 내분비 세포는 뇌의 포만 창자 음식 간의 인터페이스 감각 때문에 장 내분비 세포에 화학 감각 수용기의 특정 위치를 결정하는 것은, 비만 약물 요법의 개발에 필수적인 정보이다.
The authors have nothing to disclose.
Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Bohórquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.
Phosphate buffered saline | Life technologies | 10010023 | |
Heparin sodium salt | Sigma | H4784 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4%, freshly made in PBS, final pH 7.4 |
Glutaraldehyde | Sigma | G5882 | |
Dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
Low-melting agarose | Life technologies | 16520-100 | 5%, freshly made in PBS |
Standard Tissue-Tek Cryomold | Electron Microscopy Sciences | 62534-25 | |
DAPI nuclear stain | Life technologies | D1306 | |
Postively charged glass slides and coverslips | |||
Fine art paintbrush #1 | |||
Cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 11650 | |
Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21700 | |
EMbed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
Liquid releasing agent | Electron Microscopy Sciences | 70880 | |
Liquid silver colloidal | Electron Microscopy Sciences | 12630 | |
CircuitWorks conductive epoxy | ITW Chemtronics | CW2400 | |
Variable flow peristaltic pump | VWR | 70730-064 | |
VT1200S Vibrating blade microtome | Leica | ||
Zeiss 780i confocal microscope | Carl Zeiss | ||
Sigma VP Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss | ||
3view system | Gatan | ||
Renovo Neural Inc (Cleveland, OH) | http://www.renovoneural.com | Renovo provides 3d EM services | |
Fiji software | Open access software | ||
Computer station with 16GB of RAM or more | |||
Data visualization software Imaris 7.5 | Bitplane |