JoVE Journal > Immunology and Infection
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫学と感染

Het analyseren van de functies van mastcellen in Vivo met behulp van ' MastCell Knock-in' Muizen

Published: May 27, 2015
doi:
10.3791/52753
, , , , ,
1病理学科,Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology,Stanford University School of Medicine

概要

We beschrijven een methode voor het genereren van in vitro afgeleide mestcellen, hun engraftment in mastceldeficiënte muizen, en de analyse van het fenotype, aantallen en distributie van geïgrafeerde mestcellen op verschillende anatomische locaties. Dit protocol kan worden gebruikt om de functies van mestcellen in vivote beoordelen .

Abstract

Mastcellen (MC’s) zijn hematopoëtische cellen die zich in verschillende weefsels bevinden en vooral overvloedig aanwezig zijn op plaatsen die zijn blootgesteld aan de externe omgeving, zoals huid, luchtwegen en maagdarmkanaal. Vooral bekend om hun schadelijke rol in IgE-afhankelijke allergische reacties, zijn MC’s ook naar voren gekomen als belangrijke spelers in gastheerverdediging tegen gif en binnendringende bacteriën en parasieten. MC-fenotype en -functie kunnen worden beïnvloed door micromilieufactoren die kunnen verschillen afhankelijk van de anatomische locatie en/of op basis van het type of stadium van ontwikkeling van immuunresponsen. Om deze reden hebben wij en anderen de voorkeur gegeven aan in vivo benaderingen boven in vitro methoden om inzicht te krijgen in MC-functies. Hier beschrijven we methoden voor het genereren van van beenmerg afgeleide gekweekte MC’s (BMCMCs), hun adoptieve overdracht in genetisch MC-deficiënte muizen en de analyse van de aantallen en distributie van adoptief overgedragen MC’s op verschillende anatomische locaties. Deze methode, genaamd de‘mast cell knock-in’-benadering, is de afgelopen 30 jaar veel gebruikt om de functies van MC’s en MC-afgeleide producten in vivote beoordelen . We bespreken de voordelen en beperkingen van deze methode, in het licht van alternatieve benaderingen die de afgelopen jaren zijn ontwikkeld.

Introduction

Mastcellen (MC’s) zijn hematopoëtische cellen die ontstaan uit pluripotente beenmergfgenitatoren1-3. Na uitzetting van het beenmerg migreren MCs-voorlopers naar verschillende weefsels waar ze zich ontwikkelen tot volwassen MC’s onder invloed van lokale groeifactoren1-3. Tissue-resident MC’s bevinden zich strategisch op host-omgeving interfaces, zoals de huid, de luchtwegen en het maagdarmkanaal, waar ze zich gedragen als een eerste verdedigingslinie tegen externe beledigingen3-6. MC’s worden vaak subgeklasseerd op basis van hun “baseline” fenotypische kenmerken en hun anatomische locaties. Bij muizen zijn twee soorten MC’s beschreven: “bindweefsel-type” MC’s (CTMCs) en mucosale MC’s (MMC’s)1-3,7,8. CTMCs bevinden zich vaak rond venules en in de buurt van zenuwvezels en bevinden zich in serosale holtes, terwijl MMC’s intra-epitheliale locaties in de darm en het ademhalingsslijmvlies1-3bezetten.

Talrijke methoden zijn toegepast om biologische functies van MC ‘s9-13te bestuderen . Veel groepen hebben zich gericht op in vitro benaderingen met behulp van cellijnen (zoals de menselijke MC-lijnen HMC114 of LAD215,16),で vitro afgeleide MC’s (zoals menselijke perifere bloedafname MC’s17, of muis beenmerg-afgeleide gekweekte MC’s [BMCMCs]18, foetale huid-afgeleide gekweekte MC’s [FSCMC’s]19 en peritoneale cel-afgeleide MC’s [PCMC’s] Al deze modellen worden veel gebruikt om moleculaire details van MC-biologie te bestuderen, zoals signaleringsroutes die betrokken zijn bij MC-activering. Een belangrijk aspect van de MCs-biologie is echter dat hun fenotypische en functionele kenmerken (bijv.cytoplasmatisch granulaat proteasegehalte of reactie op verschillende stimuli) kunnen worden gemoduleerd door anatomische locatie en micromilieu2,7. Aangezien de exacte mix van dergelijke factoren die in vivo worden aangetroffen moeilijk in vitrokan worden gereproduceerd , geven wij de voorkeur aan het gebruik van in vivo benaderingen om inzicht te krijgen in MC-functies9.

Er bestaan verschillende muizenstammen met genetisch MC-deficiëntie, zoals de veel gebruikte WBB6F1–Kit W/W-v of C57BL/6-Kit W-sh/W-sh muizen. Deze muizen missen expressie en/of activiteit van KIT (CD117), de receptor voor de belangrijkste MC groeifactor stamcelfactor (SCF)21,22. Als gevolg hiervan hebben deze muizen een ernstig MC-tekort, maar hebben ze ook extra fenotypische afwijkingen die verband houden met hunc-kitmutaties (in de WBB6F1–Kit W/W-v muizen) of met de effecten van de grote chromosomale inversie die resulteert in verminderde c-kit expressie (in de C57BL/6-Kit W-sh/W-sh muizen)9,10,12,23. Meer recentelijk zijn verschillende muizenstammen metc-kit-onafhankelijke constitutieve MC-deficiëntie gemeld24-26. Al deze muizen en enkele extra nieuwe soorten inductieve MC-deficiënte muizen zijn onlangs in detail beoordeeld9,10,13.

Hier beschrijven we methoden voor het genereren van van beenmerg afgeleide gekweekte MC’s (BMCMCs), hun adoptieve overdracht in MC-deficiënte muizen en de analyse van de aantallen en distributie van adoptief overgedragen MC’s op verschillende anatomische locaties. Deze zogenaamde “mast cell knock-in”-methode kan worden gebruikt om de functies van MC’s en MC-afgeleide producten in vivote beoordelen . We bespreken de voordelen en beperkingen van deze methode, in het licht van alternatieve benaderingen die de afgelopen jaren zijn ontwikkeld.

Protocol

Alle dierverzorging en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health en met de specifieke goedkeuring van het Institutional Animal Care and Use Committee van Stanford University. 1. Generatie en karakterisering van van beenmerg afgeleide gekweekte mestcellen (BMCMCs). Opmerking: Donor BMCMCs moeten worden gegenereerd uit beenmergcellen met dezelfde genetische achtergrond als de ontvangende MC-deficiënte muiz…

Representative Results

Een overzicht van de ‘mastcel knock-in’ benadering is weergegeven in figuur 1, en omvat de generatie van BMCMCs, het aantal cellen dat i.p., i.d. of i.v. moet worden gegrafeerd in MC-deficiënte muizen (het aantal kan worden gevarieerd indien aangegeven op basis van het experimentele ontwerp) en het interval tussen engraftment en experiment afhankelijk van de injectieplaats (dit interval kan ook variëren, indien aangegeven; b.v., neemt het gehalte aan opgeslagen mediatoren in MC cytopl…

Discussion

Bijna 30 jaar na de oorspronkelijke beschrijving38blijft de‘mast cell knock-in ‘-benaderingwaardevolle informatie verschaffen over wat MC ‘s wel of niet in vivokunnen doen . Lang werd gedacht dat de functies van MC’s beperkt waren tot hun rol bij allergie. Gegevens die zijn gegenereerd met behulp van de‘mast cell knock-in’-benaderinghebben deze visie veranderd, door bewijs te leveren dat MC’s onder andere een cruciale rol kunnen spelen in de verdediging van de gastheer tegen bepaalde…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

N.G. is de ontvanger van beurzen van de Franse “Fondation pour la Recherche Médicale FRM” en de Philipp Foundation; R.S. wordt ondersteund door de Lucile Packard Foundation for Children’s Health en het Stanford NIH/NCRR CTSA award nummer UL1 RR025744; P.S. wordt ondersteund door een Max Kade Fellowship van de Max Kade Foundation en de Austrian Academy of Sciences en een Schroedinger Fellowship van het Austrian Science Fund (FWF): J3399-B21; S.J.G. erkent steun van National Institutes of Health grants U19 AI104209, NS 080062 en van Tobacco-Related Disease Research Program aan de Universiteit van Californië; L.L.R. erkent steun van de Arthritis National Research Foundation (ANRF) en National Institutes of Health grant K99AI110645.

Materials

1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30G x1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1 % Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
  2. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
  3. Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
  4. Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
  5. Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
  6. Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
  7. Galli, S. J. Mast cells as ‘tunable’ effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
  8. Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
  9. Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
  10. Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
  11. Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models – Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
  12. Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
  13. Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
  14. Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
  15. Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
  16. Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
  17. Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
  18. Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
  19. Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
  20. Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
  21. Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
  22. Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
  23. Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
  24. Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
  25. Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
  26. Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
  27. Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
  28. Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
  29. Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
  30. Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
  31. Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
  32. Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
  33. Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
  34. Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  35. Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
  36. Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
  37. Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
  38. Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
  39. Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
  40. Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
  41. Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
  42. Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
  43. Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
  44. Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
  45. Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
  46. Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
  47. Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
  48. McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
  49. Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
  50. Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
  51. Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
  52. Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
  53. Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
  54. Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
  55. Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
  56. Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
  57. Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
  58. Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
  59. Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
  60. Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
  61. Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
  62. Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
  63. Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
  64. Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. ‘Sash’ mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
  65. Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
  66. Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).

タグ

Mast CellsIn VivoKnock-in MiceBone Marrow-derived Cultured Mast CellsAdoptive TransferAnatomical DistributionHost DefenseAllergic Reactions

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using ‘Mast Cell Knock-in‘ Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image