Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.
Tümörler (iyi huylu karşıt olarak), normal dokuların Invasion genel malign önemli bir özelliğidir olarak kabul edilir. Özellikle bazı kanserler için (. Örneğin, bu tür glioblastoma multiforme ve baş skuamöz hücreli karsinom ve boyun gibi beyin tümörleri – SCCHN) şiddetli bir morbidite nedenidir ve yaşamı tehdit eden uzak metastaz yokluğunda bile olabilir. Buna ek olarak, relaps kanserleri, ne yazık ki sık sık, bu daha agresif bir fenotip ile işleme tabi. Bu nedenle, standart anti-proliferatif ajanlar tamamlayıcı olabilir yeni tedavilerin sağlamak işgali sürecini hedef için bir fırsat var. Şimdiye kadar, bu strateji işgalinin ayrıntılı bir analiz için ve ilaç taraması için uygun, sağlam, tekrarlanabilir testlerinin olmaması engel olmuştur. Burada basit bir mikro-plaka yöntemi sağlayan (üniforma dayalı, kendinden montaj 3D tümör parçacıklarının) bu tür stu için büyük bir potansiyele sahipölür. Ayrıca, bir insan glioblastoma hücre çizgisi ve hedeflenen epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) engelleyicilerine karşı direnç gelişimi geliştirilmiş matris invaziv potansiyeli ile ilişkili bir SCCHN modeli kullanılarak analiz platformu örnekler. Sitometresi bir görüntüleme kullanarak tek ve basit bir dijital görüntü analizi ile standart mikroskopi ve görüntü yakalama gerektiren ikinci bir: Biz de yarı otomatik ölçümü iki alternatif yöntemler sağlar.
Klasik kanser ilaç geliştirme, tümör hücresi çoğalmasını inhibe eden ve / veya programlanmış hücre ölümünü (apoptoz) teşvik sitotoksik maddelerin taranması için in vitro hücre-esaslı tahliller kullanımı büyük ölçüde odaklanmıştır. Daha yakın zamanlarda, çabalar habis hücre çoğalması yatan moleküler nedenlerinin inhibitörlerinin gelişimi ile hedefli tedavilerin doğru taşındı. Bazı muhteşem sonuçlara rağmen, bu tür maddeler genellikle ilaç direnci hızla gelişmesi ile ilişkilidir. Kanser ölümlerinin çoğundan sorumludur tümör hücrelerinin invaziv ve metastatik potansiyeli olduğunu ve nüks hastalık genellikle, bu in vitro deneysel modellerde romanı tanımlamak için 1,2 tamamlayıcı dikkate almak da mantıklı bir daha agresif fenotip sunduğu göz önüne alındığında bu kanser ek anahtar 'işaretlerinden' inhibe edecek ajanlar.
Habis ilerlemesi esnasında, tümör hücrelerinin eldeçevreleyen doku işgal ve / veya uzak organlara (metastaz) yayılabilir yeteneği. Kanser hücreleri invadopodia 3,4 oluşumu ile bazal membran nüfuz eder. Bu yapılar, aktin filamentler, belirli bir yapışma proteinleri ve proteinaz ile zenginleştirilir ve toplu tümör hücre motilitesi ve hücre dışı matrisi (ECM) 5 degradasyonundan sorumlu olan. Invadopodia ECM içine uzanır ve tümör hücre istilası için önemli olduğu ve aynı zamanda kan yoluyla (ya da lenfatik) yayılması ve metastazının kolaylaştıran, vasküler kanallara ekstravazasyonu inanılmaktadır.
Mevcut standart metotlar şunlardır, in vitro olarak tümör hücresi istilasını değerlendirmek. Transwell tabanlı veya Boyden haznesi deneyleri, tek hücre süspansiyonları, ECM-türevli proteinler kalın bir tabaka ile kaplanmış bir filtre üzerine ekilir 2,6. Hücreler daha sonra, istila ve kemo-cezbedici yanıt olarak alt bölme içine hareket eder. Yaygın kullanılan ECMproteinler tip I kollajenin, ya da temel zarların doğal bileşimi benzer (EHS tümöründen 7 türetilen BMM, örneğin, Matrigel), bir bazal membran benzeri bir matris.
Filtre tabanlı Boyden odasının tipi deneyleri 8 bir alternatif olarak, hücreler jel içine işgal ayrı ayrı veya topluca, sonra, bir tek tabaka ve biçim (fibroblastlar ilave edilebilir olduğu) bir ECM jel üzerine tohumlanabilir. Invasion jel yüzeyi 9 gitti işgal hücreler ve / veya mesafe sayısı cinsinden ölçülebilir. Genellikle hücreleri çevreleyen matris 2,6,10,11, tümör kütle üzerinden işgal etmeye izin ECM Jel- iki katman arasına yerleştirilen – Tümör hücreleri, aynı zamanda, bir matris içine ya tek bir hücre süspansiyonu olarak ya da küresel cisimler olarak gömülebilir.
Burada tarif edilen üç boyutlu (3D), tümör istilası küremsi tahlil bir highli kullanılarak hızlı, otomatikleştirilebilir istilası sistemi sağlarOyuk başına bir sfero sahip 96 oyuklu bir plaka formatında y tekrarlanabilir, standart bir yöntem 12. BMM tümör hücreleri, sferoid vücuttan işgal içine, bir yarı-katı bir matris sağlamak üzere her bir oyuğa, doğrudan ilave edilir. 96 saat – tümör hücresi istilasını derecesi 72 arasında bir süre boyunca aralıklarla izlenir. Bu yöntem, yukarıda belirtilen mevcut in vitro invazyon tahlilleri aşağıdaki avantajları sağlar: hücre, bir tümör mikro-bölge veya mikro-metastazı taklit 3D yapı halinde organize tümör; Tümör sferoidler boyutunda yüksek oranda tekrarlanabilir; işgali tahlil ikincil plakalara taşımak gerek kalmadan, tümör sfero geliştirme gibi aynı tabakta in situ yapılır; otomatik bir görüntü analiz son teknolojileri ile bir araya yöntem olup, her ikisi de yüksek oranda sağlar ve yüksek verimli, tümör hücresi istilasını analiz eder.
Görüntü analizi bir 96-yuvalı tarar sitometresi görüntüleme kullanılarak gerçekleştirilir10 dakika içinde plaka. Kesişme uygulamasını kullanarak, kapsamı ve istila oranı tek hücre ya da hücre kümeleri, tümör kürelerinden yayılan ve dinamik bir şekilde ölçülebilir matris içine işgal yoluyla elde. Düşük hacmi, görüntü analizi için alternatif bir yöntem, bir ters mikroskop ve standart görüntüleme yazılımının kullanılması göre sunulmuştur.
Burada açıklanan iki tümör modelleri (glioblastoma ve SCCHN) özel klinik olarak etkili tedaviler 12 karşılanmamış bir ihtiyacı olan uygun lokal invaziv kanserler gibi bizim 3D tahlil örneklemek üzere seçildi. Ilaç tedavisi, in vitro farmakodinamik (PD) biyobelirteç değişikliklerin değerlendirilmesi BMM ve / veya bütün tümör parçacıklarının istila immünofloresan analizi hücre kurtarma izin vermek için belirli bir ticari olarak temin edilebilen reaktifler kullanımından sonra Western blot ya lizatların bağışıklık ile kolayca gerçekleştirilebilir aşağıdakı montaj boyama.
Bu işgal tahlil bir yararlı olan bir yarı katı ortam içine tümör hücresi istilasını hızlı ve yeniden üretilebilir bir değerlendirme için bir teknik ve in vitro ilaç tarama gelecek için, bu nedenle özellikle uygundur. Kanser hücreleri tümör sfero tarafından temsil edilen bir "mikro-tümör", dışarı yayıldı gibi bir 3D şekilde matris işgal ve bir extracellul içine uzatmakar matris gibi bir ortam. deneyinin gerçek üç boyutluluk, katı bir substrat üzerinde hareket ederken hücreler kabul düz, yapışkan morfolojisi farklı hücre morfolojisi, belirgindir. istila derecesi kolay ya da görüntüleme yazılımı ile kombinasyon halinde, standart bir mikroskop kullanılarak otomatik bir okumasını sağlayan sitometresi görüntüleme kullanılarak ölçülür. Ayrıca, bu yöntem, uygun bir flüoresan görüntüleme 13 (floresan proteinleri veya ifade eden hücre çizgileri, örneğin floresan boyalar ile birlikte, önceden etiketlenmiş).
küremsi arasında merkezi bir konuma rahatsız riski olduğu zaman bir yöntem BMM eklenmesiyle ile temsil edilen sadece kritik bir aşama ile gerçekleştirmek için basit bir de U-şeklindedir. Bu farklı odak düzlemlerinde sferoidlerle, optimal görüntü analizi ile sonuçlanabilir. O her oyuğa dikkatlice ve yavaşça BMM eklemek nedenle önemlidir. BMM ek sonra plaka kontrol edilmesi tavsiye ediliryerelleştirme kabul edilemez ise mikroskop altında ve bu nazik santrifüj çözülebilir. Tecrübesi ile, bu nadiren gereklidir. Bu yöntem dayanıklı ve yeniden üretilebilen iken arası deney varyasyonu BMM farklı gruplar ile oluşabilir. Bunu önlemek için, bu çalışma bir dizi tamamlamak için tek bir toplu yeterli BMM satın almak için tavsiye edilir.
Yöntemin bir sınırlama (herhangi bir tür deneylerde olduğu gibi), tümör hücrelerinin muhtemelen deney zaman dilimi içinde tabi yayılmasını ve çoğalmasını, ayırt edilmesinin güçlüğüdür. Hücrelerin iki katına çıkma süresi dikkate alındığında, ya da sitokalasin D gibi hücre döngüsü önleyicileri dahil edilebilir, ancak bu kontrol etmek ya da açık bir şekilde, özellikle hızlı büyüyen tümör hücreleri için ve bu tümör ilerlemesi, bu iki farklı açıdan birbirinden ayırt etmek kolay olmadığı bir daha "geniş" yerine infiltrasyon, işgal desen var. Bu nedenleBu paralel bir 3D büyüme deneyi herhangi bir inhibitör ya da uyarıcı maddelerin spesifik etkisini değerlendirmek için gerçekleştirilmektedir önerilmektedir. Dikkatli doz yanıt çalışmalar yapılmaktadır, bu çoğalması üzerindeki etkilerini en aza indirmek konsantrasyonları seçmek mümkün olabilir. Mesela HSP90 17-AAG% 50 (GI 50) 12 3D büyümesini inhibe etmek 24 saat sonra ve konsantrasyon altındaki konsantrasyonlarda önce, U-87 mg 3D tümör küremsi invazyonu inhibe inhibitörü olduğunu göstermiştir.
Öte yandan, bu deneyde önemi diğer standart invazyon tahlilleri (örneğin, filtre dayalı tahliller ya da 3 boyutlu matrislerle 1 içine tek hücrelerin istila) ile karşılaştırıldığında, tümör hücrelerinin benzer olduğunu, sfero çevreleyen matris içine işgal olduğunu " Bu nedenle mikro tümör "ya da bir" mikro-metastaz "ve tümör kitlesi patofizyolojisinde hesabı önemli yönlerini içine alır. Sunduğumuz yöntem hakkında bilgi verirBaşlangıçta sferoitleri bırakarak, hem de bireysel olarak, tek hücreler BMM daha uzak bölgelere ulaştığında tümör hücrelerinin, kolektif davranış. Ayrıca, tümör küremsi içinde hücreler hipoksi ve besin yoksunluğu yaşayabilirsiniz ki, gen ifadesi değişiklikler yoluyla, göç ve işgali teşvik edebilir; Bu tür özellikler 2D deneylerde yoktur. Ayrıca, tüm bu daha karmaşık bir 3D deney kolay hedef doğrulama ve ilaç keşfi kullanılmak üzere izin, belirli bir 96 oyuklu plakalar kullanılarak yüksek verimli bir format ve son görüntüleme tekniği mevcuttur.
Sunduğumuz yöntem tümör hücresi invazyonu ek yönlerini ele ileri uygulamalar barındırabilir. Özellikle, karmaşıklık sfero kendisi ve saran matris içine, fibroblastlar ve / veya endotel hücreleri gibi konakçı hücreler, ilavesiyle düşünülebilir. Bu aynı zamanda, sertlik bakımından (çeşitli ortak kullanımı ile değil, değiştirilebilirBMM ncentrations) değil, aynı zamanda bileşim açısından (kabul tümör modelinde özel doku / organ göre diğer bileşenlerin eklenmesiyle: Meme karsinomu 17) beyin kanserleri 16 ve kollajen örneğin, tenasin.
(Sferoitlerin ve görüntüleme) yol benzer bir düzenleme, aynı zamanda, tümör sferoidler ya da diğer hücre spesifik organoids (örneğin, astrositler ile kompleks doku 12 benzeyen embriyoid organları ile birlikte kültürlenir 3D, doku istilası değerlendirmek için adapte edilebilir glioma 18 veya kript gastrointestinal kanserler için kültürler), ancak daha fazla çalışma otomatik görüntü analizi etkinleştirmek için gereklidir.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Web address |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | http://www.corning.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3432-005-01 | http://www.trevigen.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
Ultra-low attachment 96-well plate | Corning | 7007 | http://www.corning.com |
EGF | Miltenyi Biotec | 130-093-825 | http://www.miltenyibiotec.com Add 100 µl 1% BSA (w/v) in water to 100 µg EGF. To 25 µl of this, add 4,975 µl RHB-A medium to give a 10 µg/ml working stock. Aliquot and store at -20ºC |
RHB-A medium | Stem Cells Inc. | SCS-SF-NB-01 | http://www.stemcellsinc.com For diluting EGF |
DMEM | GIBCO | 31966-021 | http://www.lifetechnologies.com/ Warm in 37 °C waterbath before use |
Fetal Bovine Serum | Biosera | 1001/500 | http://www.biosera.com Heat at 56 °C to inactivate complement before use |
TrypLE | GIBCO | 12605 | http://www.lifetechnologies.com/ Cell dissociation solution |
Celigo cytometer | Nexcelom Bioscience | n/a | http://www.nexcelom.com Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative |
IX70 inverted microscope | Olympus | n/a | http://www.olympus.co.uk/ Used with camera for manual image capture |
Retiga Exi Fast 1394 digital camera | Qimaging | n/a | http://www.qimaging.com/ Attached to microscope for manual image capture |
Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Software used to control camera and microscope for manual image capture |
Image-Pro Analyzer 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size |
Excel 2010 | Microsoft | n/a | http://www.microsoft.com/ Scientific graphing and statistical software |
Prism 6.0 | GraphPad | n/a | http://www.graphpad.com/ Scientific graphing and statistical software |