Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopic imaging is a fast and label-free approach to obtain biochemical data sets of cells and tissues. Here, we demonstrate how to obtain high-definition FT-IR images of tissue sections towards improving disease diagnosis.
High-definition Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopische beeldvorming is een opkomende aanpak om gedetailleerde beelden die biochemische informatie hebben geassocieerd te verkrijgen. FT-IR imaging weefsel is gebaseerd op het principe dat verschillende gebieden van het midden-infrarood geabsorbeerd door verschillende chemische bindingen (bijvoorbeeld C = O, CH, NH) in cellen of weefsel die vervolgens kan worden gerelateerd aan de aanwezigheid en de samenstelling van biomoleculen (bv, lipiden, DNA, glycogeen, eiwitten, collageen). In een beeld FT-IR, elke pixel in het beeld omvat een volledige infrarood (IR) spectrum die informatie kan geven over de biochemische status van de cellen die vervolgens kunnen worden benut celtype of ziekte-type classificatie. In dit artikel laten we zien: hoe IR beelden te verkrijgen van menselijke weefsels met behulp van een FT-IR-systeem, hoe de bestaande instrumenten aan te passen om voor high-definition imaging-mogelijkheden, en hoe je FT-IR-beelden te visualiseren. Vervolgens geven we een aantal toepassingen van de FT-IRpathologie met de lever en nieren als voorbeelden. FT-IR beeldvorming houdt interessante toepassingen in het leveren van een nieuwe route naar biochemische informatie van cellen en weefsels in de richting van het geven nieuw inzicht in de biomoleculaire veranderingen als onderdeel van ziekteprocessen te verkrijgen in een geheel label-free geen storing veroorzaakt route. Bovendien kan deze biochemische informatie potentieel zorgen voor objectieve en geautomatiseerde analyse van bepaalde aspecten van diagnose van de ziekte.
IR spectroscopie is een analytische tool die beschikbaar is in een of andere vorm sinds de jaren 1930; echter alleen in het laatste decennium dat het weefselgebied beeldvorming met FT-IR geëxplodeerd is. De vooruitgang in de FT-IR voor tissue beeldvorming zijn gedreven grotendeels door drie belangrijke ontwikkelingen: 1) verhoogde snelheid van data-acquisitie door de beschikbaarheid van grote Focal Plane Array (FPA) detectoren die typisch duizenden IR detectoren 1 , 2, 2) de ontwikkeling van geavanceerde algoritmen en rekenkracht om grote hyperspectrale data verwerken sets 3, en 3) het modelleren van de FT-IR-imaging systemen om ruimtelijke resolutie van 4,5 maximaliseren. Er zijn tal van hoge kwaliteit en zeer uitgebreid artikelen herziening het gebied van FT-IR spectroscopie onlangs 6-16, naast een Nature Protocols papier stappen punt spectra of kaarten uit weefsels 17 verkrijgen Details geweest. In dit artikel zullen we ons richten op de protocol om beelden van weefsels met behulp van een 128 x 128 FPA-detector in een gewijzigde FT-IR-systeem met high-definition-mogelijkheden te verkrijgen.
FT-IR imaging al lang zouden een potentieel wenselijke het weefsel- en beeldvorming als gevolg van de mogelijkheid om beelden waarin elke pixel een schat aan biochemische informatie. FT-IR imaging is gebaseerd op het principe dat verschillende biomoleculen in een monster kwantitatief verschillende gebieden van het midden-infrarood absorbeert; dit zorgt voor het afleiden van een "biochemische vingerafdruk. Deze vingerafdruk was in veel studies aangetoond veranderen tussen verschillende celtypen en ziektetoestanden. In tegenstelling tot conventionele pathologie praktijk waarbij vlekken en immunohistochemische markers moeten worden voor het visualiseren en identificeren van celsoorten en weefselstructuren die worden gebruikt voor diagnose en behandeling opties begeleiden, worden de beelden van FT-IR gevormd op basis van de inherente biochemie van het weefsel. De huidige techniqUE kleuring weefsel voor diagnose is tijdrovend, destructieve, arbeidsintensief en vereist subjectieve ervaring van de patholoog, terwijl FT-IR biedt de mogelijkheid om dit proces snelle, niet-destructieve, sterk geautomatiseerd en objectiever maken. Bovendien FT-IR verschaft een nieuwe route ter verkrijging aanvullende biochemische informatie die niet gemakkelijk toegankelijk kan zijn met gebruikelijke kleuringstechnieken.
Eén van de meest interessante ontwikkelingen in de laatste jaren heeft de beschikbaarheid van hoge resolutie beeldvormingstechnieken die nu kan zorgen voor de visualisatie en karakterisatie van celtypen en weefsels structuren die essentieel zijn voor uitgebreide ziektediagnose zijn geweest. Een van deze technieken is Attenuated totale-reflectie (ATR) FT-IR, die een solide immersie lens (SIL) van een hoge brekingsindex die zorgt voor een hoge resolutie imaging 18, met een groot aantal zeer spannende studies toont zijn toepassingen 19-25 bevat. Bovendien wzoals onlangs aangetoond dat de verhoogde ruimtelijke resolutie geassocieerd met ATR beeldvorming kan zorgen voor de visualisatie en classificatie van endotheliale cellen en myo in borstweefsel die een belangrijke component van borstkanker diagnose 26 vormen. ATR beeldvorming is zeer nuttig, deze techniek vereist dat de SIL contact met het weefsel FT-IR beelden te vormen; daarom wordt het gebruik ervan enigszins beperkt voor weefselpathologie waar grote gebieden van weefsels snel moet worden afgebeeld.
Een tweede benadering werd aangetoond door het koppelen van een hoge vergroting doel bestaande FT-IR systeem een synchrotron gebruik als een heldere bron van infrarood, is het mogelijk te helderen FPA en beeld met een effectieve pixelgrootte van 0.54 x 0.54 pm. Dit liet voor ons om belangrijke structuren te visualiseren in de borst en prostaat weefsels die niet oplosbaar met behulp van conventionele FT-IR-systemen 4. Terwijl deze dramatische toename in het IR ruimtelijke resolution waren spannend, het gebruik ervan beperkt gebleven vanwege die een synchrotron. Vervolgens werd een optimaal systeem ontworpen dat ook kan zorgen voor high-definition imaging-mogelijkheden met een 1,1 x 1,1 micrometer pixelgrootte zonder de eis van een synchrotron bron maar met behulp van een traditionele globar IR bron 5. In dit artikel laten we zien hoe een bestaande commerciële FT-IR-imaging-systeem mogelijk te maken diffractie beperkte IR beeldvorming van weefsels met een acceptabel signaal-ruisverhouding met behulp van meerdere IR-doelstellingen (15X, 36X en 74X) te wijzigen. De effectieve pixelgrootte met de drie doelstellingen is 5,5 x 5,5 micrometer (15X), 2.2 x 2.2 micrometer (36X) en 1,1 x 1,1 micrometer (74X). Vervolgens hebben we een paar voorbeelden geven van het belang van de winsten in de ruimtelijke resolutie voor de ziekte van detectie in lever en nieren biopten 27.
FT-IR is een nieuwe modaliteit voor labelvrije biochemische beeldvorming van weefselsecties, met potentieel een belangrijke rol bij het verbeteren van de huidige standaard van diagnose pathologie. De huidige gouden standaard voor pathologie vereist weefsel biopsie, gefixeerd in formaline, ingebed in paraffine, in secties verdeeld meerdere malen, en gekleurd met meerdere vlekken. Een getrainde patholoog moet de weefselstructuur en cellulaire morfologie subjectief visueel beoordelen om een diagnose te bepalen. Hier laten we zien hoe infraroodbeelden hoge resolutie verzamelen van hetzelfde type profielen en bespreekt sommige van de computationele benaderingen chemische verschillen tussen celtypes en ziektetoestanden onderzoeken.
De kritische stappen in dit protocol zijn dat de weefsels zorgvuldig gericht en dat het systeem goed gekalibreerd zeer hoge kwaliteit spectroscopische gegevens. De zorg bij het opzetten van het systeem is bijzonder criti cal bij het werken met een hoge vergrotingsfactor doelstellingen. Om te helpen bij het oplossen van problemen, de volgende lijst bevat enkele van de mogelijke problemen;
Probleem: Lage IR intensiteit wanneer beeldvorming in reflectie. Oplossing: Controleer de IR-slide richting als het reflecterende coating kunnen worden op de verkeerde kant van de dia.
Probleem: Laag signaal / rood waarschuwingsbord in Lancer Controle. Oplossing: Cool detectoren met LN2. Vloeibare stikstof is nodig voor de FPA detectoren en vereist periodiek worden bijgevuld.
Probleem: Velocity fout / beweging fouten. Oplossing: Reset spectrometer en trillingen te verminderen. Vibrations zal de bewegende spiegel in de interferometer te worden verstoord.
Probleem: Waterdamp pieken in de gegevens. Oplossing: Verhoog purge op het systeem en het monster te beschermen tegen lucht.
Probleem: Ongeldige centerburst. Oplossing: Vind centerburst opnieuw.
e_content "> Probleem:. lage flux verschil in transmissie, hoewel gericht. Oplossing: Stel bottom condensor Dit ontstaat als IR licht niet gericht wordt naar een punt op het monster.In dit artikel hebben we ons gericht op hoe je high definition IR beelden van weefsels te verwerven in beide transmissie of transflectance modus. De aard van FT-IR imaging, is dat er meerdere wijzigingen die kunnen worden aangebracht in de data-acquisitie, zoals type substraat, fixatie techniek monsterdikte, spectrale resolutie, interferometer mirror snelheid etc. Het effect van deze parameters heeft onlangs 4,5,17,51 besproken in uitgebreide detail.
Er zijn een aantal wijzigingen kunnen worden aangebracht in het afbeeldingssysteem inclusief beeldvorming in de ATR mode 10,24,26 en met nanoschaal thermische benaderingen 52,53 zodat voor hoge resolutie IR imaging. De belangrijkste beperking met hoge resolutie IR-beeldvorming is dat de tissues moet zorgvuldig worden voorbereid en dun genoeg om door IR (typisch 4 urn dik) te passen. Bovendien transmissie en reflectie FT-IR imaging vereist de monsters droog te wijten aan de absorptie van IR water. Echter, FT-IR imaging heeft belangrijke voordelen boven andere technieken, omdat het kan zeer snel beeld grote stukken weefsel terwijl afleiden rijke en gedetailleerde biochemische informatie. Andere soortgelijke technieken die biochemische informatie af te leiden in een label-free mode bevatten Raman spectroscopie, maar de tijd van data-acquisitie is veel langzamer om beelden te verwerven. Nieuwe Raman beeldvorming benaderingen zijn in opkomst, waaronder gestimuleerde Raman scattering (SRS) en Coherent Antistokes Raman scattering (CARS); zij hebben echter toegang te beperkte spectrale bereik of enkele frequentie beeldvorming.
De vooruitgang in de snelheid van data-acquisitie, ruimtelijke resolutie, en de beschikbaarheid van computationele benaderingen zijn van enorme waarde geweest in het maken van FT-IR IMAGing een meer haalbare aanpak voor de vertaling als een nieuwe imaging tool in de pathologie. De recente ontwikkelingen in de ruimtelijke resolutie zijn vooral van belang voor weefselpathologie geweest als gevolg van de belangrijkste celtypen niet zijnde oplosbaar met behulp van conventionele FT-IR imaging systemen. Het recente document door Reddy et al. liet zien hoe een ideaal systeem om de optimale ruimtelijke resolutie van een FT-IR-imaging-systeem 5 verkrijgen modelleren. De nierweefsel voorbeeld in dit document toont het belang van een hogere ruimtelijke resolutie om biochemische informatie uit glomerulaire structuren (Figuur 3 jp Figuur 5) extract. In de toekomst, nieuwe ontwikkelingen in Quantum Cascade Lasers als zeer helder IR lichtbronnen 54-57, 3D spectral imaging 58, en doorbraken op het gebied van nano-IR technologieën 52,53,59,60 houden spannende nieuwe mogelijkheden van het onderzoek dat kan hebben enorme gevolgen voor de toekomst van weefsel beeldvorming.
<p class = "jove_content"> We hebben voorgesteld toepassingsvoorbeelden in lever- en nierziekte waar er een behoefte aan aanvullende biochemische informatie die van diagnostische waarde zijn. De Spectral Pathologie Laboratorium in de afdeling Pathologie aan de Universiteit van Illinois in Chicago is gericht op de vertaling van IR-imaging technologieën ter verbetering van diagnose van de ziekte en een betere voorspelling van de prognose van de patiënt. FT-IR beeldvorming kan overwinnen van een aantal van de huidige beperkingen in de pathologie praktijk waar kwantitatieve en objectieve informatie nodig is. In het bijzonder wordt de toekomstige werkzaamheden gericht op het identificeren van gebieden in de huidige pathologie praktijk waar de huidige technieken geen adequate diagnostische gevoeligheid bieden of bieden beperkte informatie. Een duidelijke behoefte bestaat in het verbeteren van de huidige praktijk van de pathologie en richting geven van meer informatie aan de patholoog over ziektestatus van de patiënt kan worden verwezenlijkt kan worden met behulp van high-definition FT-IR imaging.The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge the Department of Pathology at the University of Illinois at Chicago for financial support. Histology and visible imaging services were provided by the Research Resources Center – Research Histology and Tissue Imaging Core at the University of Illinois at Chicago established with the support of the Vice Chancellor of Research, in particular we would like to thank Ryan Deaton and Andy Hall for their expertise. We would also like to thank Agilent Technologies, in particular Frank Weston for support and loaning of additional IR lens.
Cary 600 Series FT-IR system | Agilent | Multiple configurations | Alternate FT-IR imaging systems exist |
Adjustable ReflX Objective 74X/0.65NA IR | Edmund Optics | 66-592 | |
Adjustable ReflX Objective 36X/0.5NA IR | Edmund Optics | 66-586 | |
MirrIR slide | Kevley Technologies | CFR | For FT-IR reflection-mode measurements |
Barium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Calcium Fluoride slides | International Crystal Laboratories | Multiple sizes | For FT-IR transmission-mode measurements |
Dry Nitrogen/Dry Air gas | Multiple gas suppliers | Multiple sizes | |
Hexane | Sigma Aldrich | Multiple sizes | For deparafinizing tissue |
Liquid Nitrogen | Multiple cryogenic liquid suppliers | Multiple sizes | |
ENVI-IDL software | Exelis-Vis | Other software packages available | |
Whole slide Imager | Scanscope (Aperio) or Nanozoomer (Hamamatsu) | To image stained slides |