ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

注：RNAで作業上の注意：RNaseによるRNAの分解から保護するために、標準的な予防措置を講じてください。プロトコルのすべての段階で手袋、バリアピペットチップ、RNaseフリープラスチック容器や薬品を使用してください。すべてのソリューションのために超高純度またはDEPC処理水を使用してください。製造業者のプロトコルに従ってのRNase不活化溶液による疑わしい表面を除染。 ソリューションの調製。 塩基性溶液を500mlの準備（0.3 MのNaCl、15ミリモルのMgCl 2·6H 2 O、15mMのトリス-HCl、pH7.4）。溶液が透明になるまで撹拌棒を用いて混合し、0.45μmのフィルターを通過する。室温で保管してください。 以下のように10〜50％スクロース溶液と60％のチェイス溶液を調製： 10％ショ糖液は、（w / v）の50ml遠心チューブ中で5gのスクロースを追加し、塩基性溶液で50mlにフィル。 50ml遠心管広告を50％ショ糖溶液（w / v）になるためのD 25gのスクロースおよび塩基性溶液50ミリリットルに記入してください。 60％（w / v）のチェイス·ソリューションを50ml遠心管に30gのスクロースを追加し、塩基性溶液で50mlにフィル。 60％のチェイス溶液に、（未溶解の粉末をペレット化遠心分離機を超えないが、溶解するまで水にブロモフェノールブルーを追加）飽和ブロモフェノールブルー溶液100μlを加える。ボルテックスを用いて混合し、完全な溶解を確認します。 4℃で保存するソリューションが必要になるまで。 RNA溶解バッファーを準備します。実験の日に新鮮なこのバッファを準備します。各サンプルについてのRNA溶解バッファー500μlのを準備します。基本ソリューションの1ミリリットルに10μlのトリトンX-100（1％[V / V]最終）、DMSO（CHX、0​​.1ファイナルmg / ml）で、3.5μlのRNasinを（140 U、100 mg / mlのシクロヘキシミドの1μlを添加する/ mlで）。ボルテックスを用いて混合します。氷の上に保管してください。 注：シクロヘキシミドは非常に有毒であり、突然変異を引き起こすことがある。皮膚接触や吸入を避ける。あまりにも頻繁に粉末状の取り扱いを避けるために、予備校DMSO、アリコート中に100mg / mlストックの大きい量であり、長期保存のために-80℃で維持する。 -20℃での在庫を働き続ける。 実験の日には、所望の10％の体積と50％ショ糖溶液（勾配当たりの各溶液を〜7ml）溶液にCHX（0.1mg / mlの最終濃度）を添加することにより、ショ糖+ CHX溶液を調製。 自動化されたグラデーションメーカーを使用してスクロース勾配の調製 （！criticalstep）勾配メーカー '' ON ''とレベル勾配が保持するプレートを回し板が平準化されたとき '' '完了Done」をクリックします。 メニュー上で実行されるべき勾配プログラムを選択します。 プレス '' GRAD ''メニューと '' LIST ''を選択します。 「SW41」を選択します。 リストをスクロールし、選択キーを押しによる 'プログラム' '10 – 11のステップ – 50％の勾配を」'' RUN ''ボタンをる。 マーカーブロックに円錐形の超遠心管（SW-41チューブ、14×89ミリメートル）を配置し、マーカーブロックの上段に沿ってチューブ上のマークをトレースするために提供細管マーカーを使用しています。安定した表面上のフィッティングラックにチューブを置きます。 注：このマークは、10および50％ショ糖ソリューションを重ねるための充填ガイドになります。 2 10ミリリットルの注射器に提供されている2つのカニューレを取り付けおよびRNaseの不活性化溶液を含む温かい蒸留水で上下にピペッティングによって洗う。その後の水の痕跡をすべて削除してください。 10％ショ糖+ CHXでの注射器のいずれかを記入し、超遠心管の底にカニューレを挿入します。それだけで、チューブで行わマークを過ぎて行くまで、慎重に10％ショ糖溶液を分注する。 注：泡を作ることは避けてください。気泡が形成した場合、優しく、それらを変位させるチューブをタップします。 余分な液体を拭き取る、50％ショ糖+ CHXと他の注射器を埋めるで拭き、軽く超遠心管の底にカニューレを挿入します。それが正確にマークに達するまで穏やかに50％スクロース溶液を分注する。迅速かつスムーズにカニューレを取り外します。 注：10％ショ糖がチューブ内に上昇し、上部のメニスカスを形成すべきである。そうでない場合、表面での10％スクロース溶液を加える。 少し超遠心管を傾け、すべての気泡を変位させることによって提供キャップを挿入します。マイクロピペットキャップのリザーバ内に過剰な液体を除去。 管壁に沿って余分な液体を拭き取ると、勾配メーカープレート上に置きます。 '' RUN ''ボタンを押してください。 注：プレートは、指定された角度で傾けて5秒間一時停止し、勾配を形成するための回転が開始されますでしょう。 勾配形成が完了すると（約2分、機械音がします）、静かに、超遠心機（複数可）を削除するラック上に配置し、迅速gradieを乱すことを避けるために上向きの動きにキャップを外しNT。 氷の上に勾配（複数可）を保管してください。邪魔しないで！別の方法として、勾配は4℃で一晩保管してください。 または、次のようにグラデーションを作るために2室勾配メーカーを使用します。 RNアーゼ不活性化溶液とRNaseフリー水で洗い流しチューブおよび勾配メーカー。 グラデーションメーカーの近位チャンバに50％ショ糖+ CHXの5ミリリットルを加え、2つのチャンバ間に空気が除去されることを確認してください。 グラデーションメーカーの遠位チャンバに10％ショ糖+ CHXの5ミリリットルを追加します。 チューブホルダー内コニカル遠心管（SW-41チューブ、14×89ミリメートル）と場所の底に50％ショ糖+ CHXの0.5ミリリットルを追加します。 「3」（約1ミリリットル/分）に設定された速度で近室に入れ、攪拌機、オープンストップコックおよび預金勾配をオンにします。 氷の上に置いて勾配（複数可）。邪魔しないでください。 NOTE：勾配を4℃で一晩保持することができる。 3.細胞溶解および超遠心分離。 <ol style=「マージン左：40px; "> 4℃にSW-41ローターと4℃でのバケツとセット遠心分離機を置きます。 注：細胞溶解手順の二つの150mmサブコンフルエント（〜70-80％コンフルエント）勾配当たりのHEK293細胞のプレート用に最適化され、使用されるボリュームは、異なる細胞株のために調整する必要があるかもしれない。 溶解前に少なくとも24時間、増殖培地中で適切な細胞密度で細胞をプレート。 0.1 mg / mlのCHXを含む増殖培地のアリコート（150 mmのプレートあたり20ミリリットル）を準備します。 逮捕およびポリソームを安定化させるために37℃/ 5％CO 2で3分間（150mmのプレートあたり20ml）でCHX +培地中の細胞をインキュベートする。 迅速に作業、プレートから吸引メディア氷上場所プレートおよび10 mlの氷冷リン酸緩衝生理食塩水で細胞を1回洗浄（PBS：137のNaCl、2.7mMのKClを、10mMののNa 2 HPO 4、1.8mMのKH 2 PO 4）を補充しCHX（0.1mg / mlの最終濃度）をsidの下をゆっくりピペットに注意しながらと細胞単層の浮き上がりを最小限にするディッシュの側壁の電子。 吸引しPBSおよび各プレートに追加の10mlのPBS + CHXを追加するには、セルリフターを用いて細胞をこすり、氷上に50ミリリットルの遠心管に両方のプレートから、全量を移す。下流タンパク質分析のために氷上で微量遠心管に細胞懸濁液1mlを保持する。 遠心機で10分間4℃で300×gで細胞を50mlチューブ。 すべてのPBSを削除し、氷冷RNA溶解バッファー500μlにペレットを再懸濁します。 2ミリリットルのマイクロチューブに細胞懸濁液を転送します。 ピペットアップおよび溶解細胞へのダウンと時折ボルテックスしながら10分間氷上でインキュベートする。 ペレット核に5分間4℃で2000×gで遠心。 新しい2 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移し。 5分間、4℃で17000×gで遠心分離し、細胞破片をペレット化する。 新しい2 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移し、測定するために2μlの使用260nmでの光学密度（ブランクとして溶解緩衝液を使用）。 全RNAの解析のために各サンプルから50μlを（全体の10％）を取り外します。必要になるまで溶解物は-80℃で保存することができます。 静かにそれぞれのショ糖勾配上に等しいA260ユニットをロードします（。500μLの最大音量で10分OD、25 OD最適;必要に応じて追加の溶解緩衝液で集中溶解液を希釈）。 確保勾配は互いに前に超遠心0.1gの範囲内である。 4℃で1.5時間39000 rpmで（260343 XG）での遠心分離勾配。 スピンダウン中にオンローターブレーキを保持し、それが1,000回転に達したときに減速時にそれをオフにする。 注：このステップは、ブラシヘッドは制動時にローターを接点として、加速度の急激な変化によって引き起こさ勾配のあらゆる妨害を最小限に抑えます。 4.グラデーション分別システムトゥルセットアップ。 セットアップ楽器とブランクS次のように水でpectrophotometer： コンポーネントの電源を入れ、ランプが少なくとも15分間ウォームアップすることができます。 確認し、フラクションコレクターは「ポリソーム 'メソッド（;ホーム画面に戻るには二度の矢印を返す回押しフォルダアイコン）に設定されています。 フラクションコレクターにバルブを確保するには、（ゴミ箱アイコンに矢印）無駄に設定されています。廃棄物収集チューブ下に蒸留水を入れた250ミリリットルの三角フラスコを置きます。 チャートレコーダー上で、以下の設定を選択します。Set感度が「SETランプとオプティクス」にダイヤルする。 「1.5」にノイズフィルタスイッチを設定します。 「OFF」にピークセパレーターダイヤルを設定します。 '30センチ/ hrで '（5センチメートル/ 10分）に設定しチャ​​ートスピードダイヤル。ベースラインが「MAX OPEN」に（分光光度計ユニットの上に）ダイヤルを調整して設定する。 注：オプション：デジタルレコーダーソフトウェアではなく、チャートレコーダーを使用することもできる。コンピュータ上で、「開始」をクリックしてください。取得ウィンドウが開きます：番目の下でE [オプション]メニュー、チェックを外してポーズグラフィック。スケーリングの下で​​は、（実行中にオンザフライで変更可能）-10と100にグラフの制限を設定する。新しいファイルを作成し、実行を記録するために[保存]ボタンをクリックしてください。 ポンプにシリンジバレルを置き、場所（使用付属のネジと六角レンチ）に締めます。 注：締めすぎないようにしてください。 RAPID速度で '' REV ''コマンドを使って、チェイスSolutionで注射器を埋める。直立した状態でポンプを置き、 '' FORWARD ''コマンドを使用して、チューブを通して空気を追いかける。これだけの機能と洗浄のための迅速なを使用しています。 RNaseフリー水で満たされた超遠心管を取り付けます。 ピアースは、2つの黒のマークまで、カニューレとの超遠心管は表示されます（小出し穴がこれら二つのマークの間に位置している）、および6.0ミリリットル/分で '' 'マニュアル'上シリンジポンプを起動します。 水がフローセルを通過する際に、（Cとき長谷ソリューションは、変数に、）スイッチの速度をチューブの1/3を満たし、1.0ミリリットル/ minに設定してください。 1.0ml /分の流速で、ベースラインをチャート上の電圧がゼロ（+/- 0.5単位）になるまで、分光光度計で調整ダイヤルの調整。 注：三角フラスコに廃液チューブから水出口を観察します。 「0.5 'または' 1.0 'のAUへの所望の感度を設定します。 注：1.0 AUが10ミリリットルの勾配で10 ODユニットに最適です。 ODが10未満である場合には、「0.5」感度は、シグナルを増強するために使用することができる。 自動ベースラインボタンを押して、（デジタルレコーダーを使用している場合はオプション）レコーダーオフセットダイヤルを回すことで、チャートレコーダーの10％のマークに設定するベースラインを調整します。 安定したベースラインが達成されるとデジタルレコーダーを使用している場合、アナログチャートレコーダまたは 'off'を使用した場合、60センチメートル/時に「OFF」とチャートスピードダイヤルにポンプスイッチをオンにします。 RE 'にポンプを切り替えることにより、チェイス·ソリューションを回復それは、穿刺カニューレ上の最初のマークに到達するまで（いずれかがRAPIDを使用しないでください…バック6.0ミリリットル/分の流量を増やすことができ、必要であれば）V 'の位置。 遠心管を取り外し、それを介してチェイスソリューションの少しを実行することにより、カニューレ内に気泡を追いかける。きれいなピアス段を拭きます。 注：一部の残留水がフローセルから漏れることができる。 5.グラデーション画とサンプルの収集。 インストールし、スクロース勾配を含む遠心管に穴を開ける。 キャップが上向きに突出しないようにフラクションコレクタートレイ位置1-11 11 2ミリリットルマイクロチューブを置きます。採集管に残った液体を収集するために ''廃液チューブ ''と今は ''チューブ＃1 ''を交換してください。 「手動」にポンプ制御ダイヤルを設定し、「6.0ミリリットル/分 'にシリンジポンプで流速</lI> フラクションコレクター上の「再生」アイコンを押してください。とすぐに腕が第一の管に到達すると、 ''ポーズ ''ボタンを押してください（これは腕を置き、分数分配バルブが開きます）。 '' FORWARD ''コマンドを使用してポンプを起動し、チャートレコーダーペンを監視します。それが上向きに偏向起動すると、すぐに 'を'廃液チューブ '' ''チューブ＃1 ''を交換する（そのサンプルは、分光光度計のフローセルを通過していることを示す）。 最初のドロップが収集される場合には、速やかに「リモートスタート/ストップ '、' '変数（1.0ミリリットル/分）' 'を押して' 'プレイ' 'のアイコンにコマンドを切り替えます。 注：ポンプは今フラクションコレクター·インターフェースによって制御され、1mlの画分毎分を収集することができる。 この時点から、A260の読みはデジタルレコーダーインタフェース（またはアナログチャートrecordeに表示されますr）を。ソフトウェア上の ''録音 ''ボタンが押されたことを確認してください！ 青いチェイスSolutionは捕集管または最後のチューブ（通常はチューブ11）を入力した後、「停止」アイコンを押してください。 注：ディスペンスバルブは廃棄バルブに切り替えてください。 すべての勾配は分画してきたまで氷上画分を保管してください。日画分の終わりに先立って、タンパク質またはRNAの単離に-80℃で保存することができる。タンパク質およびRNA分析が必要な場合は、半分の各画分（タンパク質およびRNA分析のために500μlのそれぞれ）を分割する。 6.ウォッシュ注：（これは、複数の勾配を収集する場合にのみ行われるべきオプションのステップです）。 超純水の約50 mlを入れた三角フラスコに廃液チューブを沈め6 ml /分の流速を用いてポンプを逆転。 チェイスSolutionは最初のマークOを達したときにポンプを停止穿刺カニューレがn。 、遠心管を取り外し、カニューレの外に空気を追いかけるとピアス段を清掃してください。 注：一部の残留水がフローセルから漏れることができる。 ステップ5.1から始まる分画手順を繰り返します。 7.最終的なクリーンアップ。 ピアサの底からポンプチューブを外し、急速な流量設定を使用して、50ミリリットルの遠心分離管にチェイスソリューションを送り出す。それが再利用できるように、4℃でチェイスソリューションに保管してください。 3ウェイチューブシステムにポンプチューブを接続し、シリンジにつながるバルブを閉じてください。ピアサのベースに蒸留水や他のチューブで満たされた50ミリリットルの注射器に1のチューブを接続します。 ブランキング工程のために使用超遠心管を取り付け、 ''スターをクリックすることにより、インターフェイス上でコレクションメニューに分光光度計とコレクションチューブ（スイッチを介して蒸留水の少なくとも50ミリリットルを渡すT /一時停止 ''アイコン）。 チューブ、注射器（ネジを外すアレンキーを使用します）、他のすべてのリムーバブルコンポーネントを削除し、暖かい水道水を使って徹底的に洗浄した後、超純水ですすいでください。 注：プランジャー、バレル、チューブを洗浄し、カニューレを貫通するとき、特別な注意を払ってください。 注：注意してガラスシリンジバレルをハンドル！ほこりからすべてのコンポーネントを格納する。 蒸留水で湿らせた柔らかいティッシュでフローセルの底を拭いてください。フラクションコレクタートレイとショ糖がこぼれてきた可能性のある他の領域を拭う。 ショ糖画分からのRNAの8離。 すべての蔗糖画分の1ミリリットル（37.5μlの10％SDS、7.5​​μlの0.5M EDTA、1μlのグリコブルー、20 mg / mlのプロテ​​イナーゼKの4μl）を用プロテイナーゼK溶液50μlを準備します。 2ミリリットル平底チューブ中、55℃でプロテイナーゼK溶液50μlで1mlのショ糖画分をインキュベート1時間（500μlの画分を使用する場合はそれに応じて、プロテイナーゼK溶液の体積を調整する）。 クロロホルム：等量のフェノールを追加3-メチル-1-ブタノール、ショ糖画分から（125：24 1、好ましくは酸性（pHは4.5）DNAの混入を最小限にするため）。 注：彼らは重く、位相が反転し始める可能性があるため、フラクション7-10にクロロホルムを余分に200μlのを追加します。 注：フェノール/クロロホルムは、接触および吸入に火傷を引き起こす可能性があります。白衣を着用し、安全ゴーグル、および換気フードを使用しています。 室温で5分間、最大速度でボルテックス〜30秒遠心操作する。 〜水相の80〜90％を除去新しいチューブ内と場所（ゲノムDNAが含まれている可能性がある相間触れないでください）​​。 等量のクロロホルムを追加し、ステップ8.4を繰り返します。 相間を避けるために注意しながら水相を除去します。 、3 M酢酸ナトリウムの1:10ボリュームを追加pHが5.2（または5 M酢酸アンモニウムを使用することができる）。 チルド、absoluの1.5ボリュームを追加15秒間TEエタノールと渦。 -20℃（または-80℃で1時間のラッシュである場合）で一晩沈殿させる。 注：サンプルは、-20のままにしておくことができます 必要に応じてより長いのためのC°。 4℃で30分間、最高速度で遠心。 チルドRNaseフリーの70％エタノール1mlでペレットを洗浄。 空気はRNaseフリー水20μlにペレットを再懸濁を乾燥。 （A260 / 280の比率に基づいて）十分な収率および純度を確保し、各画分の等量と目的のmRNA（単数または複数）に特異的なPCRプライマーを使用して、標準的なRT-qPCR分析14に進んで分光光度計によって、総RNAを定量化する。 ショ糖画分からのタンパク質の9離。 RNAに加えて、タンパク質は、同様に、個々のポリソーム画分中に単離され、同定され得る。タンパク質の分離、 例えば 18に利用可能な多くの優れたプロトコルのいずれかを使用してください。