选择性的mRNA翻译在哺乳动物细胞中的核糖体性能分析评估

注 ： 注与RNA的工作：采取标准预防措施，以防止RNA降解RNA酶。使用手套，防护吸管头，无RNase的塑料制品和化工产品中的所有步骤的协议。使用超纯或DEPC处理过的水用于所有的解决方案。净化任何怀疑表面用按照制造商的协议RNA酶失活的溶液。 1.准备解决方案。 制成500毫升之基本溶液（0.3 M氯化钠，15毫摩尔的MgCl 2·6H 2 O; 15毫摩尔的Tris-HCl，pH 7.4）中。混合使用搅拌棒，直到溶液澄清并通过0.45μm的过滤器。在室温下储存。 制备10和50％蔗糖溶液和60％大通解如下： 对于10％的蔗糖溶液（W / V），在50 mL离心管中加入5克蔗糖，并填写到50毫升的基本解决方案。为50％的蔗糖溶液（重量/体积），在50毫升的离心管中的广告D 25克蔗糖，并填写到50毫升的基本解决方案。 60％（W / V）大通解决方案，在50毫升离心管中加30克蔗糖，并填写到50毫升的基本解决方案。加入100μl饱和溴酚蓝溶液（添加溴酚蓝水，直到没有更多的会溶解，离心沉淀不溶解的粉末），以60％追的解决方案。混合使用一个旋涡，并确认完全溶解。 商店溶液在4℃下直到需要。 准备RNA裂解缓冲液。准备这个缓冲区新鲜的实验当天。制备500微升的RNA裂解缓冲液对每个样品。到1ml的基本解的加10微升的Triton X-100（1％[体积/体积]最后），1微升100mg / ml的放线菌酮的DMSO（CHX，0.1毫克/毫升终浓度）和3.5微升的RNasin（140Ú /毫升）。混合使用涡旋。保持在冰上。 注：放线菌酮是剧毒的，并可能导致突变。避免皮肤接触和吸入。为了避免处理粉末状过于频繁，准备在DMSO中，等分试样较大的量为100 mg / ml储备，并保持在-80℃下长期贮存。保持在-20℃下工作的股票。 在实验的当天，通过添加放线菌酮（0.1毫克/毫升终浓度）为10％的所需量和50％的蔗糖溶液（〜7毫升每梯度每种溶液）制备蔗糖+ CHX解。 2.制备蔗糖梯度的使用自动梯度机打开渐变壶''ON'和水平板，其将持有的梯度（criticalstep！）点击'完成''当板拉平。 在菜单上选择渐变程序来运行： 按''GRAD''菜单，选择'LIST'。 选择“SW41”。 滚动列表，然后选择“'10 – 50％的坡度 – 11步''计划通过压荷兰国际集团的'RUN''按钮。 放置一个锥形离心管（SW-41管，14×89毫米）插入标记块并使用所提供的细管标记物跟踪沿着标记块的上面步骤中的管的标记。将管在一个稳定的表面装配架。 注：此标志将是填充指南关于分层的10和50％的蔗糖溶液。 将两个提供给用套管210毫升注射器和通过上下抽吸用含有RNA酶失活溶液温蒸馏水洗净。一定要去除水中的所有痕迹之后。 填充有10％蔗糖+ CHX注射器中的一个，并插入套管，在超速离心管的底部。轻轻地分配10％的蔗糖溶液，直到它进入刚刚过去制成的管子的标记。 注意：要避免气泡。如果形成气泡，轻轻拍打管来取代它们。 填补其他的注射器用50％蔗糖+ CHX，擦去多余的液体关闭与在超速离心管的底部上的擦拭并轻轻插入插管。轻轻地分配的50％蔗糖溶液，直到达到完全的标记。快速，顺利地取出套管。 注：10％蔗糖应该上升管中形成一个弯月面在顶部。如果没有，则添加更多的10％蔗糖溶液，在表面上。 通过倾斜超速离心管稍微取代所有气泡将提供的盖子。在帽的水库有微量吸管去除多余的液体。 擦拭沿筒壁和地点上的梯度机板的剩余液体。 按''RUN''按钮。 注：该板块将在倾斜指定角度，停顿5秒，旋转，形成梯度将开始。 当梯度的形成是完整的（约2分钟，机器会发出哔哔声），轻轻取下超速离心机（S），放在架上，并迅速在向上运动瓶盖取下，以避免干扰gradie新台币。 保持梯度冰（S）。请勿打扰！另外，梯度保持一夜之间在4℃。 另外，使用两腔梯度制造商进行渐变，如下所示： 冲洗管道和梯度机用RNA酶失活溶液和无RNA酶的水。 加入5 ml的50％蔗糖+ CHX对梯度制造者的近端腔室，并确保该两个腔室之间的任何空气被除去。 加入5毫升10％蔗糖+ CHX对梯度制造商的远端室。 添加0.5毫升50％蔗糖+ CHX对底部的锥形离心管（SW-41管，14×89毫米），并装在管保持架。 打开搅拌器放在近端室，开停，公鸡和存款梯度速度设置为“3”（约1ml /分钟）。 处的梯度（多个）上的冰。请勿打扰。 注释：梯度可以保持过夜，在4℃。 3.细胞裂解和超速离心。 <ol style=“保证金左：40PX;”> 放置SW-41转子和轮叶在4℃下，并设置离心机至4℃。 注：细胞裂解过程被优化为2150毫米汇合（〜70-80％汇合）每梯度HEK293细胞的板和所用的量可能需要调整为不同的细胞系。 板的细胞在生长培养基中至少24小时之前，裂解的合适的细胞密度。 制备含有0.1mg / ml的放线菌酮的生长培养基的等分试样（每150毫米的钢板20ml）中。 孵育细胞CHX +媒体在37℃/ 5％CO 2（每150毫米的钢板20ml）中3分钟，以逮捕和稳定多聚核糖体。 工作迅速，吸媒体从板，在冰上代替板，用10ml冰冷的磷酸盐缓冲盐水洗一次细胞（PBS：137mM的氯化钠，2.7毫摩尔的KCl，10mM的磷酸氢二钠，1.8毫摩尔KH 2 PO 4），补充用放线菌酮（0.1毫克/毫升终浓度）小心缓慢地吸取下来的sidE中的盘子壁的以最小化细胞单层的升降。 吸出PBS中，并加入另外的10毫升的PBS + CHX到每个板，刮去细胞与细胞挺杆和从两板的总体积转移至50ml离心管置于冰上。保留1毫升细胞悬浮液在冰上下游蛋白分析微量离心管中。 离心机的50ml管中的细胞在300×g离心在4℃下进行10分钟。 删除所有PBS重悬沉淀在500μl冰冷的RNA裂解液。 转移细胞悬液至2ml微量离心管中。 移液管上下裂解细胞并在冰上孵育10分钟，偶尔涡旋。 离心机在2000×g离心在4℃下进行5分钟以沉淀细胞核。 转移上清液至新的2ml微量离心管中。 离心机以17000×g离心在4℃下进行5分钟以沉淀细胞碎片。 转移上清液至新的2ml微量离心管中，并使用2微升测量在260nm处的光密度（用裂解缓冲液作为空白）。 从每个样品中总RNA的分析去除50微升（共10％）。注裂解物可以储存在-80℃直到需要。 等于A260单位轻轻放入到每个蔗糖梯度（10个OD，最佳25 OD，在500微升的最大音量;如果需要稀释浓缩的裂解额外的裂解缓冲液）。 确保梯度内0.1克彼此之前超速离心。 梯度离心在39000转（260343 XG）1.5小时，在4℃。 在降速过程保持转子制动器和减速时将其关闭，当它达到1000转。 注：此步骤最大限度地减少了加速度的突然变化造成的刷头在制动过程中与转子上的梯度的任何干扰。 4.梯度分馏系统仪器设置。 设置仪器和空白的S用水pectrophotometer如下： 打开组件和允许灯预热至少15分钟。 确保馏分收集器被设置为“核糖体”的方法（按文件夹图标的两倍;返回箭头两次，返回到主屏幕）。 确保在馏分收集器的阀设置为浪费（箭头指向垃圾桶图标）。把这个包含废物收集管下蒸馏水的250ml锥形瓶中。 选择在图表记录进行以下设置：设置感光度转盘“SET灯和光学的;设置噪声滤波器开关'1.5';山顶设置拨号器，以“OFF”;设置图表单键拨号'30厘米/小时“（5厘米/ 10分钟）;设置基线调节旋钮（在分光光度计单元的顶部），以“最大打开'。 注：可选配：数字录音机软件，可以用来代替图表记录。在计算机上，单击“开始”。采集窗口将打开：下个ê选项菜单，取消暂停图形。在缩放，设置图形的限制-10〜100（可改变运行期间的即时）。点击保存按钮来创建一个新的文件，并记录运行。 放置在所述泵的注射器和枪管和拧入位置（设置使用螺钉和六角扳手）。 注意：不要拧得过紧。 通过使用''反转''命令的速度快装满大通解决方案的注射器。放置在垂直位置，泵以及使用该''前进'的命令通过管道追空气。仅使用RAPID此功能和洗涤。 安装一个超速离心管填充有不含RNA酶的水。 皮尔斯的超速离心管与套管直到两个黑色标记是可见的（分配孔位于这两个标记之间），并开始注射泵上''手动''为6.0毫升/分钟。 当水通过流动池传递（当cHASE溶液填充该管的1/3），开关速度变量和设定为1.0毫升/分钟。 以1.0ml / min的流速，调整基线调整拨盘上的分光光度计直到图表上的电压是零。（+/- 0.5单位）。 注：观察从废液管出口处的水进入锥形瓶中。 设置所需的灵敏度为'0.5'或'1.0'AU。 注：1.0 AU在10ml的梯度最适合10的OD单位。如果OD值低于10时，'0.5'的灵敏度，可以用于增强信号。 按下自动基线按钮，通过旋转记录的偏移拨号（使用数字录像机选购IF）调整基线设置，在图表记录了10％大关。 一旦稳定的基线实现，如果使用模拟图表记录仪或'OFF'，如果使用数字录音机打​​开泵开关为“OFF”和图表快速拨号至60厘米/小时。 通过切换泵'再恢复大通解决方案V'的位置（如果需要的话可以增加流量回至6.0毫升/分钟。请不要使用RAPID），直到它到达的穿刺插管的第一个标志。 取出离心管中，并通过其上运行的解决方案大通一点点追套管内的任何气泡。擦拭穿孔阶段干净。 注：某些残留的水可能泄漏从流动池。 5.梯度分离和收集样品。 安装和刺穿含有蔗糖梯度的离心管中。 将112毫升离心管中馏分收集器托盘位置1-11这样的帽子不向上突出。更换''管＃1''现在有一个'废管'来收集遗留在收集管的液体。 泵控制转盘设置为“手动”和流速的注射泵，以“6.0毫升/分钟” </l我> 请按馏分收集器“播放”图标。一旦臂到达第一管中，按'暂停'按钮（这将定位臂和打开分数分配阀）。 启动泵使用'前进'的命令和监控图表记录笔。当它开始向上偏转（表示样品通过分光光度计的流通池），快速更换'废物管''与''管＃1''。 当第一滴收集，快速切换命令“远程启动/停止'，''变量（1.0毫升/分钟），''，按'播放'图标。 注：该泵现在由馏分收集器接口控制和1ml的级分被收集每一分钟。 从这一点上，A260读数将出现在数字记录器接口（或模拟图表recorde上R）。确保''记录'上的软件按钮被按下！ 蓝色大通溶液进入收集管或最后管（通常管11）后，按“停止”图标。 注：分配阀应切换到排污阀。 保持分数上的冰，直到所有的梯度被分级。在一天的部分的端部可存放在-80℃之前，蛋白质或RNA分离。如果需要的蛋白质和RNA的分析，对半分割的每个级分（每500微升的蛋白质和RNA分析）。 6.洗注：（这是要只进行一个可选的步骤，如果多个梯度将被收集）。 淹没废液管到含有锥形瓶中〜50毫升的超纯水和用6毫升/分钟的流速反向泵浦。 停泵时，大通溶液到达的第一个标记0n中的穿孔套管。 取下离心管中，追任何空气从套管和清洁穿孔阶段。 注：某些残留的水可能泄漏从流动池。 重复分馏过程始于步骤5.1。 7.最后的清理。 断开从穿孔器的底部泵管和泵的大通解成使用快速流量设定在50ml离心管中。存储解决方案大通在4℃，因为它可重复使用。 泵管连接到一个3路管道系统，并关闭阀通向注射器。连接一个管到50ml注射器中加入蒸馏水和另一管的穿孔器的底部。 安装用于冲裁步骤中的超速离心管，并通过分光光度计和收集管（切换到集合菜单的界面上通过点击“”星传递至少50毫升蒸馏水T /暂停“”图标）。 取出试管，注射器（用内六角扳手卸下螺丝）和所有其它可移动部件和用温自来水彻底清洗，然后冲洗用超纯水。 注意：清洗柱塞，桶，油管和套管刺入时要特别小心。 注：处理玻璃注射器针筒小心！存储所有组件远离灰尘。 擦拭流动池的底部与软组织蘸有蒸馏水。擦拭馏分收集器托盘和那里的蔗糖可能已经洒任何其他地区。 8.隔离从蔗糖分数的RNA。 制备50微升蛋白酶K溶液，每1毫升蔗糖级分（37.5微升10％SDS，7.5微升0.5M EDTA，1微升Glycoblue，加入4μl20mg / ml的蛋白酶K）。 在2毫升平底管中，孵育1毫升蔗糖级分用50μl的蛋白酶K溶液在55℃下1小时（如果使用500μl的级分调整相应的蛋白酶K溶液体积）。 添加的苯酚用等体积氯仿：异戊醇（125：24：1，优选酸性的（pH值4.5），以尽量减少DNA污染）的蔗糖级分。 注意：添加一个额外的200微升氯仿馏分7-10，因为他们是重，阶段可以得到反转。 注：酚/氯仿可能造成接触和吸入灼伤。穿白大褂，防护眼镜，并使用通风柜。 涡流〜30秒，以最大速度离心5分钟，在室温下进行。 删除〜水相的80-90％（不碰相间其中可能包含的基因组DNA），并将其放置在新的试管中。 加入氯仿并重复步骤8.4等体积。 除去水相要小心，以避免相间。 加一点10体积的3M乙酸钠，pH为5.2（可替换的5M乙酸铵可以使用）。 加入1.5倍体积的冷藏，绝对完美德乙醇，涡旋15秒。 一夜沉淀在-20°C（或1小时，在-80℃，如果赶时间）。 注：样品可在-20留下 °下，如果不再需要。 以最大速度离心30分钟，在4℃下。 用1毫升冷冻的不含RNA酶的70％乙醇洗涤沉淀。 空气干燥沉淀，并重新悬浮于20μl不含RNA酶的水。 通过分光光度法定量的总RNA，以确保有足够的产率和纯度（基于A260 / 280的比例），并使用每个级分的特定的感兴趣的基因（多个）相同体积和PCR引物进行标准的RT-qPCR的分析14。 9.隔离从蔗糖馏分蛋白。 除了RNA，蛋白质可被分离和鉴定在单个多核糖体级分也是如此。使用可用于蛋白质分离许多优秀的协议， 如 18之一。