Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.
Plaque essais restent l'une des méthodes les plus précises pour la quantification directe de virions infectieux et des substances antivirales par le comptage des plaques discrètes (unités infectieuses et les zones mortes cellulaires) en culture cellulaire. Ici, nous démontrons comment effectuer un test de la plaque de base, et comment les superpositions et les techniques différentes peuvent affecter la formation de plaque et de la production. Typiquement, les substrats de recouvrement solides ou semi-solides, tels que l'agarose ou de la carboxyméthylcellulose, ont été utilisées pour limiter la propagation virale, la prévention de l'infection aveugle à travers le milieu de croissance liquide. Superpositions immobilisées limitent infection cellulaire à la monocouche immédiatement environnante, ce qui permet la formation de foyers dénombrable discret et la formation de plaque postérieure. Pour surmonter les difficultés inhérentes à l'utilisation de revêtements traditionnels, un nouveau revêtement liquide en utilisant de la cellulose microcristalline et la carboxyméthylcellulose de sodium a été de plus en plus utilisés en remplacement dans la normedosage de plaque. Liquides dosages de plaques de recouvrement peuvent être facilement réalisées en SD formats de plaques et 6 ou 12 selon les techniques traditionnelles et ne nécessitent aucun équipement spécial. En raison de son état liquide et la facilité d'application ultérieure et l'enlèvement, formats de plaques de microculture peuvent également être utilisés comme une alternative de débit rapide, précise et haute de titrages viraux à plus grande échelle. Utilisation d'un polymère liquide non visqueux chauffé offre la possibilité de rationaliser le travail, conserve réactifs, l'espace de l'incubateur et augmente la sécurité de fonctionnement lorsqu'il est utilisé dans les laboratoires de confinement traditionnels ou élevés que pas de chauffage du réactif ou la verrerie sont nécessaires. Superpositions liquides peuvent aussi se révéler plus sensibles que les superpositions traditionnels pour certains virus labiles.
L'isolement et la quantification précise des échantillons viraux viables a toujours été un objectif de recherche en cours en virologie. Il a fallu attendre l'avènement de l'essai de plaque en 1952 un moyen de calculer quantitativement et qualitativement les titres viraux animaux a d'abord été développé 1,2. Cette technique a été adapté et modifié à partir d'essais de phage, qui avait déjà été utilisée pour calculer les titres d'actions bactériophages en biologie végétale 1,2. Bien que d'autres moyens pour la quantification virale ont depuis été développée et adaptée, telle que des analyses immunologiques par fluorescence et par microscopie électronique à transmission, accordable de détection d'impulsion résistive (de TRPS), la cytométrie en flux, les systèmes rapporteurs recombinantes, et inverse quantitative réaction en chaîne par polymérase (qRT-PCR) Ces méthodes ne parviennent pas à identifier et quantifier les virions réplication compétentes 1,3. Bien que les progrès dans les technologies et les techniques continuent à affiner et modifier le paysage; PLAQUe tests continuent de représenter l'étalon-or dans la détermination des concentrations virales de virions infectieux lytiques 1,4.
Au cours d'un essai sur plaque, une monocouche confluente de cellules de l'hôte est infecté par un virus lytique d'une concentration inconnue qui a été dilué en série à une gamme dénombrable, typiquement entre de 5 à 100 virions. Les monocouches infectées sont ensuite recouvertes d'un milieu de recouvrement de blocage pour empêcher la propagation de l'infection virale indifféremment soit par le flux de convection ou mécanique du milieu liquide au cours de la propagation virale. Alors que les superpositions solides ou semi-solides tels que l'agarose, cellulose de méthyle ou la carboxyméthylcellulose (CMC) ont traditionnellement été utilisés, les superpositions liquides sont devenus une alternative de plus en plus attrayant avec le développement de nouveaux revêtements de liquides tels que Avicel 5- 7. Plaque essais utilisant liquide contre superpositions traditionnels ont plusieurs avantages comme la superposition peut être applié à la température ambiante, et l'application et le retrait est beaucoup plus facile. Comme superpositions liquides ne nécessitent pas de réchauffement, les virus labiles délicates et de chaleur peuvent aussi se révéler plus facile à la plaque.
Après l'infection initiale et l'application du revêtement de blocage, les plaques individuelles, ou des zones de mort cellulaire, commencera à développer l'infection virale et de la réplication que sont limités à la monocouche environnante. Les cellules infectées continueront le cycle de réplication de lyse-infection, la propagation de l'infection en outre, résultant en plaques de plus en plus distincts et discrets. Selon la cinétique de croissance et de la cellule hôte viral utilisé, une plaque visible font normalement dans 2-14 jours. Monocouches cellulaires peuvent alors être comptées avec un microscope en champ clair standard, ou plus généralement fixés par et contre-rouge neutre ou cristal violent afin d'identifier facilement les plaques à l'œil nu. Il existe une grande variété de la plaque contre les taches disponibles, chaque offre eEIR Les avantages et les inconvénients spécifiques. Le cristal violet est généralement ajouté au point de collecte et après la fixation / enlèvement de la couche supérieure, fournir une contre-coloration rapide et distinct qui permet d'identifier de très petites plaques lorsque morphologie mixte est présent. Le rouge neutre a l'avantage d'une application anticipée et contact constant avec la surimpression, permettant le suivi en direct de développer la formation de la plaque, ce qui est particulièrement utile lorsque vous travaillez avec un virus ou de réplication inconnus cinétique. Nous avons cependant constaté que la coloration est généralement pas aussi distinct lors de l'utilisation du rouge neutre. 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényl tétrazolium (MTT) offre plusieurs avantages, comme les taches de colorants de couleur jaune cellules plaques bleues et noires viraux peuvent être comptées sans enlèvement de la couche supérieure en tant que vivent avec du rouge neutre. Le contraste entre cellules vivantes et mortes offertes par MTT permet également la détection de petites plaques lors d'une précédente infection point de temps après, Bien que le stockage serait encore exiger le retrait de la superposition 8. Comme cristal violet peut être simplement fait dans une solution d'eau et d'alcool, et fournit un degré élevé de sensibilité pour la morphologie de la plaque mixte, nous avons choisi comme contre-colorant préféré et simplifié pour le protocole, ont démontré que nous utilisons plusieurs familles de bien virus caractérisés.
Après fixation et coloration de la monocouche cellulaire infectée, plaques sont comptées pour titrer les échantillons de stock virale en termes de unités formant des plages (UFP) par millilitre. Une chute de journal est à noter entre les dilutions en série et, en fonction de la taille de la plaque, entre 5-100 plaques comptées, avec un contrôle négatif utilisé comme une référence. Échantillons statistiquement varient de 10% pour chaque tranche de 100 plaques comptés lorsque l'on compare échantillons répétés 3. L'avantage d'utiliser la méthode des plages afin de déterminer les titres viraux réside dans leur capacité à quantifier le nombre réel de particules virales infectieuses wurant l'échantillon. Comme plusieurs virions pourraient infecter une cellule unique, la terminologie de motifs par rapport à virions est utilisé pendant les titrages de la plaque 1,2.
Plaque morphologie peut varier considérablement dans des conditions de croissance différentes et entre espèces virales. Plaque taille, la clarté, la définition de la frontière, et la distribution devraient tous être noté, car ils peuvent fournir des informations précieuses sur les facteurs de la croissance virus en question et de virulence.
Principes de dosage de la plaque de base peuvent également être adaptés et modifiés dans un certain nombre de façons différentes, par exemple dans l'utilisation de la mise au point des dosages de formage (AGL). FFA ne reposent pas sur la lyse cellulaire et contre-coloration pour détecter la formation de plaques, mais plutôt emploient immunomarquage techniques permettant de détecter directement des protéines virales intracellulaires par des anticorps marqués. Sensibilité accrue, une diminution des temps d'incubation après l'infection, et surtout la capacité à quantifier les virus non lytiques sont toutes distinctesavantages lors de l'utilisation FFA. Bien que largement utilisée, les facteurs limitants critiques dans les FFA par rapport à un essai sur plaque classique réside dans la nécessité d'anticorps appropriés et que la capacité de la sonde pour les sous-unités de protéines virales par rapport aux virions infectieux réels 4.
Aux fins de cette étude, nous limiterons notre discussion à la méthode des plages classiques et décrire l'utilisation des recouvrements solides et semi-solides traditionnels (agarose et CMC), avec de nouveaux revêtements de cellulose microcristalline liquide.
Le facteur le plus critique pour un essai de plaque succès réside dans l'optimisation du protocole pour la culture virale en question que les conditions peuvent varier considérablement. Les points clés à prendre en compte sont: accueillir compatibilité cellulaire par le virus en question, les conditions de croissance virales appropriées, gammes de dilutions suffisantes afin de différencier clairement les plaques, et la sélection de superposition correcte et coloration pour les cellules et les virus en question.
Bien que les deux VFVR VEEV et poussent dans des conditions très similaires en utilisant un grand nombre des mêmes types de cellules hôtes, les différences de morphologie et de croissance varient considérablement plaque cinétique. Lors de l'utilisation des cellules Vero pour les essais de la plaque, qui ont traditionnellement été utilisés comme une lignée cellulaire propagation et l'indicateur pour hémorragiques virus de la fièvre et des alphavirus, VEEV pousse généralement à des titres plus élevés que la FVR et démontre augmenté cinétique de réplication, le développement de grandes plaques uniformes à 48 hpi 4, 10 – 12. Contrairement à VEEV, VFVR nécessite 72 HPI et démontre plaques qui sont généralement beaucoup plus petits et de taille variable.
En opposition à VFVR et VEEV, le virus de la grippe est très cellule hôte spécifique et peut être difficile à se propager à travers la culture de tissus. Pour le virus de la grippe, l'entrée et la fusion virale est normalement initiée par la liaison du récepteur de la surface cellulaire avec la glycoprotéine hamagglutinin virale (HA), qui médie l'entrée dans la cellule cible par liaison avec le récepteur de surface de l'acide α-sialique de la cellule hôte. Est une glycoprotéine HA trimère qui est présente dans l'enveloppe de membrane de tous les virus de la grippe et nécessite un clivage dans le sous-unités HA1 et HA2 de par une protéase spécifique de la cellule hôte. Pour compliquer davantage la situation, ces sites de clivage peuvent souvent varier entre 13 souches virales. Comme l'expression de protéases capables de cliver HA est limitée à des tissus spécifiques, les protéases are souvent ajouté à des milieux de culture cellulaire dans le but de faciliter la fusion virale et l'entrée dans la cellule hôte choisie 13. TPCK-trypsine est un exemple d'une protease couramment utilisé qui est utilisé dans la culture de cellules à la fois avec des cellules MDCK et des cellules Vero: faciliter la reproduction multi-cycle (en l'absence de sérum d'inactivation de la trypsine) par l'intermédiaire de l'activation protéolytique de HA virale 14,15.
Comme démontré dans cette étude et d'autres, les différences dans les cycles de vie virales peuvent influencer sélections de superposition, les formats de plaque, et les temps de collecte, avec des écarts importants entre les classes et les espèces de virus différents. Dans notre étude, les superpositions d'agarose démontré plaques claires à des titres plus élevés que soit CMC ou superpositions liquides à la fois pour la FVR et virus de la grippe B, renforçant son utilité parmi un large éventail de virus et de types cellulaires. En utilisant une faible concentration finale de agarose grandement aidé à enlever les bouchons solides et coloration simplifiée. CMC a démontré l'ensemble, le poorest efficacité comme une superposition pour les trois virus testés et produits très petites et indistinctes plaques de virus de la grippe B. Bien que, globalement CMC a démontré les caractéristiques les moins souhaitables, son utilisation en croissance rapide et extrêmement virus virulents pourraient se révéler avantageux, car il ne semble pour réduire la taille de la plaque avec seulement une diminution minimale dans le titre. Le revêtement liquide est avéré être le plus souple en ce qu 'il est extrêmement simple à préparer, une plus grande facilité d'utilisation, et est comparable à de l'agarose à travers tous les virus sélectionnés. Dans un format de plaque débit supérieur à 96 puits, l'application et l'enlèvement n'a pas été inhibée en raison de solidification avec des superpositions traditionnels, et a fourni des résultats précis et cohérents. Une considération lors de l'utilisation des superpositions liquides réside dans la coloration opaque et l'incapacité à contrôler la formation de plaques comme les plaques ne peuvent être déplacés jusqu'à ce que le point de collecte, de limiter cette adaptation de virus avec la cinétique de réplication précédemment caractérisées.
<pclass = "jove_content"> modifications mineures dans des conditions de test de la plaque peuvent modifier significativement les résultats et l'évaluation et la performance d'un nouveau système ou technique est toujours justifié. Bien qu'un protocole de dosage de la plaque optimisée et standardisée ne existe pas pour toutes les situations, notre rapport démontrent la polyvalence et la facilité d'utilisation en traditionnel ainsi que de nouveaux revêtements liquides pour les essais de la plaque, tout en offrant suffisamment d'expérience pour des modifications ultérieures de l'utilisateur.The authors have nothing to disclose.
We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
6-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 658 160 | |
12-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 665 180 | |
96-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 655 180 | |
96-2ml deep well plate | USA Scientific | C15046314 | For serial dilutions |
DMEM | Quality Biologicals | 112 013 101 | Cell Media/Diluent |
2X EMEM for plaques | Quality Biologicals | 115 073 101 | Warm to 37 oC |
MEM 100X | Cellgro | 25 025 Cl | |
Sodium Pyruvate | Cellgro | 25 000 Cl | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140 122 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030 081 | |
HyClone FBS | Thermo Scientific | SH30910.03 | Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldritch | A7030-50G | |
Trypsin TPCK | Sigma Aldritch | T1426-50mg | Make aliquots/Avoid freeze thawing |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
DEAE-Dextran | Sigma Aldritch | D9885-10G | |
Crystal Violet | Sigma Aldritch | C3886-25G | |
Formaldehyde Solution | Sigma Aldritch | F8775-500ml | |
Ethanol denatured Reagent Grade | Sigma Aldritch | 362808-1L | |
Avicel RC-591 NF | FMC BioPolymer USA | RC-591 NF | Shake vigorously when reconsitiuting for >30 min to homogenize |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity | Sigma Aldrich | C4888 |