We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.
Cancro ovarico epiteliale è la neoplasia maligna ginecologica più letale negli Stati Uniti. Anche se i pazienti inizialmente rispondono alla attuale standard di cura costituito da debulking chirurgico e chemioterapia combinata che comprende composti del platino e taxani, quasi il 90% dei pazienti che ricorrono nel giro di pochi anni. In questi pazienti lo sviluppo della malattia chemioresistente limita l'efficacia degli agenti chemioterapici attualmente disponibili e quindi contribuisce all'elevata mortalità. Per scoprire le opzioni terapeutiche innovative in grado di indirizzare recidiva di malattia, modelli animali che imitano da vicino il profilo clinico dei pazienti con carcinoma ovarico ricorrente sono obbligatori. La sfida nel monitoraggio (ip) malattia intraperitoneale limita l'uso di modelli ip e quindi la maggior parte per via sottocutanea xenotrapianti sono stabiliti. Abbiamo sviluppato una piattaforma di imaging ottico sensibile che consente l'individuazione e la localizzazione anatomica della massa tumorale ip. La piattaforma include la use del reporter ottici che si estendono dalla luce visibile al vicino infrarosso, che in combinazione con 2-dimensionale raggi X co-registrazione può fornire localizzazione anatomica di segnali molecolari. La rivelazione viene significativamente migliorata con l'uso di un sistema di rotazione che spinge l'animale a più posizioni angolari per l'imaging 360 gradi, che permette l'identificazione di tumori che non sono visibili in un'unica orientamento. Questa piattaforma fornisce un modello unico di modo non invasivo la crescita del tumore monitorare e valutare l'efficacia di nuove terapie per la prevenzione o il trattamento del cancro ovarico ricorrente.
I modelli animali sono strumenti indispensabili nella ricerca delle scienze della vita. In particolare il cancro, i dati acquisiti da studi su animali forniscono le informazioni necessarie per avviare la sperimentazione di applicazioni diagnostiche o terapeutici nell'uomo 1-3. Modelli animali per i tumori solidi sono classicamente stabilite per via sottocutanea in quanto fornisce un mezzo semplice per misurare il carico tumorale e valutare l'efficacia del trattamento, senza dover sacrificare gli animali. In effetti, intra-peritoneale (ip) modelli richiedono che gli animali sacrificati per rilevare e misurare le variazioni di crescita del tumore. Tuttavia, per i tumori ip quali cancro ovarico, modelli ortotropici offrono il vantaggio di studiare la malattia nel suo ambiente appropriato 4-6. Per un tale modello sia di uso nella valutazione dell'attività antitumorale, metodi di imaging non invasive devono essere sviluppati che permettono la quantificazione di carico tumorale ip in topi vivi.
Una delle principali sfide nell'uso di modelli animali ip è la difficoltà di quantificare con precisione massa tumorale con l'esame fisico. Quantificazione accurata dei tumori ip di solito richiedono il mouse per essere sacrificato per la dissezione. Questo approccio richiede l'uso di elevato numero di animali, che sarebbero sacrificati a diversi tempi. Oltre al costo, introduce elevata variabilità dei dati a causa di variazioni inerenti all'interno di ogni animale. Non invasiva in vivo imaging ottico fornisce un approccio più adatta per monitorare ip massa tumorale in topi vivi.
Diversi metodi di imaging non invasive sono attualmente utilizzati nella ricerca pre-clinica per il monitoraggio della crescita tumorale e risposte terapeutiche. Questi includono la tomografia computerizzata (TC), l'ecografia (US), la risonanza magnetica (MRI), tomografia ad emissione di positroni (PET), e l'imaging ottico, come fluorescenza e bioluminescenza 7-12. CT è un processo di riproduzione di trasmissione combina raggi X e computtecnologia ER. Produce un'immagine sezione di travi rilevate di fotoni ad alta energia, che passa attraverso il corpo con velocità differente. Stati Uniti sono un tipo di immagine di riflessione, che invia i suoni ad alta frequenza per il corpo la creazione di onde sonore che si riflettono con velocità diversa a seconda della densità dei tessuti e riconosciuto dal computer per produrre una immagine visiva. MRI e PET sono modalità di imaging delle emissioni che utilizzano energia magnetica e particelle nucleari, rispettivamente, per produrre l'immagine. MRI crea un forte campo magnetico che induce le cellule a produrre le proprie frequenze radio, che vengono utilizzati per creare un'immagine mentre PET richiede una telecamera sensibile per rilevare la radioattività del marcato 7,9,11 2-fluorodeoxy-D-glucosio amministrato. Infine, imaging ottico si basa sulla rilevazione della luce di emissione del reporter o sonde 9,12 bioluminescenti o fluorescenti.
In questo rapporto, descriviamo l'uso della fluorescenza, che offrealcuni vantaggi rispetto agli altri tipi di modalità di imaging. Con fluorescenza, le cellule possono essere geneticamente ingegnerizzati per esprimere proteine fluorescenti costantemente senza richiedere l'aggiunta di un substrato o sonde basate legatura-, che sono necessarie per la bioluminescenza e la risonanza magnetica, rispettivamente. Reporter fluorescenza anche in genere esprimono un segnale luminoso consentendo l'uso di un metodo di rilevamento meno sensibile 8,12. Inoltre, con l'imaging di fluorescenza, è possibile rilevare tumori inferiori ad 1 cm, che non è ottenibile con TC 7-9. Infine, a differenza di bioluminescenza, segnale di fluorescenza non richiede un ambiente aerobico e quindi il segnale non è limitato in ambienti ipossia, che di solito verificano nei nuclei di grandi tumori 13.
Tuttavia, come qualsiasi altra tecnologia, metodi di imaging basate fluorescenti presentano svantaggi. Uno dei quali è l'incapacità del machifotoni a bassa energia ne-generato di penetrare ad una profondità sufficiente. Così, per minimizzare la quantità di fotoni tessuto diffusi gli animali devono essere esposte ad angoli differenti. Descriviamo un protocollo per stabilire un IP cancro alle ovaie in topi nudi e un approccio per il monitoraggio del tumore ip che fornisce tutta l'imaging animale attraverso la rotazione. Il rotatore angoli del mouse per posizioni specifiche e ripetibili diminuendo l'interferenza tessuto che spesso si verifica tra la sorgente luminosa e il rivelatore. Ciò consente di ottimizzare la visualizzazione dei tumori più piccoli che potrebbero altrimenti perdere.
Descriviamo un protocollo per stabilire un modello animale ip umana cancro ovarico che imita il profilo clinico osservato nei pazienti. Inoltre, si descrive l'utilizzo di un dispositivo di rotazione animale che affronta la limitazione sensibilità di immagini 2D. Nel loro insieme, queste tecniche possono fungere da piattaforme di scoprire nuovi composti in grado di indirizzare chemioresistente recidiva di cancro ovarico. Inoltre, tale modello può essere utilizzato per comprendere la biologia di recidiva e progressione del cancro.
Grazie alla sua posizione retroperitoneale, in fase iniziale ip xenotrapianti di cancro ovarico sono quasi impossibili da rilevare esaminando fisicamente il mouse. Nella maggior parte dei casi, una volta che la malattia può essere palpata, il carico tumorale è già significativo e quindi limita la valutazione dell'efficacia del trattamento. L'uso di cellule marcate modo fluorescente ci permette di valutare la creazione di tumore ip in tempo reale e quindi individuare il momento ottimale per iniziare tRATTAMENTO. In modo simile, xenotrapianti fluorescenti marcati consentono il monitoraggio della risposta al trattamento. Va sottolineato, tuttavia, che ip tumori più profonda di 1 cm non sono tipicamente rilevabili indipendentemente dal sistema reporter.
L'utilizzo di cancro ovarico cellule staminali umane 14,15,17,22 genera xenotrapianti che imitano il profilo clinico osservato nei pazienti. Come una malattia primaria, il modello è sensibile a Paclitaxel ma la cessazione del trattamento fine porta a recidive chemioresistente. Introducendo le cellule attraverso le corna uterine alla densità specificata nella sezione Protocollo di solito si traduce in tumori ovarici entro 10 giorni con un paio di impianti peritoneali, e quindi imita malattia in stadio precoce. L'uso di cellule fluorescente ci permette di valutare la creazione di tumore ip in tempo reale e di conseguenza individuare il momento ottimale per iniziare il trattamento. In modo simile, xenotrapianti fluorescenti marcati consentono il monitoraggio of risposta al trattamento. Se si utilizzano altri tipi di linee cellulari tumorali, ovarico o altro, è possibile che questo profilo non può essere osservato. Quando SKOV3 viene utilizzato ad esempio, è stato riportato che i tumori ip iniziali sono già resistenti 23. Tuttavia, se marcato con un reporter come la fluorescenza, ip, malattia può essere seguita in tempo reale.
Se viene utilizzato altro reporter fluorescente, è importante effettuare l'imaging iniziale con un controllo (senza tumore) animale. Ciò permetterà l'ottimizzazione del protocollo di imaging per ottenere lo sfondo migliore rapporto segnale. Nella nostra esperienza, topi nudi in genere hanno un alto background quando ripreso utilizzando le impostazioni di acquisizione GFP.
È importante che le cellule iniettate intrauterina sono singole sospensioni per evitare la creazione di tumori dell'utero. E 'anche importante evitare di graffiare lo strato epiteliale uterina, che facilita anche attecchimento della cellula tumorales dell'utero producendo così un tumore intrauterina invece di una malattia ip. Inoltre, durante l'analisi dei dati, è importante impostare il valore gamma di 1. Ciò assicura che l'intensità delle immagini è lineare e permette il confronto tra le immagini.
Durante l'acquisizione di immagini MARS, è importante garantire che l'estremità a valvole del musetto pieghevole è nella cavità dell'ogiva. Il nosecone funge da punto di contatto per il mouse ed è quindi necessaria per ottenere gli angoli accuratamente tarata. Per i protocolli di imaging più lunghi (cioè più di 1 ora), iniettare 100 ml di soluzione salina sterile per via sottocutanea per aiutare a prevenire la disidratazione. Temperatura del corpo animale deve essere mantenuta utilizzando aria calda fluiva attraverso il sistema a circa 37 ° C. Una limitazione del sistema MARS è che solo un animale può essere ripreso alla volta con un tempo totale di circa 1 ora per animale.
In conclusione, si descrive l'establishment di un modello animale che imita da vicino il cancro ovarico, sia malattia primaria e ricorrente. Questo modello può essere utilizzato per valutare l'efficacia delle modalità diagnostiche o terapeutici.
The authors have nothing to disclose.
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni NIH RO1CA118678 e RO1CA127913, dalla Family Foundation Sands, e la scoperta per curare Programma.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
hemostat | VWR | 82027-422 | |
Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5ml) | |
Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
MI software | Bruker Corporation | ||
athymic nude mice | Harlan |