نموذج الفئران التصوير غير الغازية لكشف ورصد سرطان المبيض تكرار
概要
We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.
Abstract
سرطان المبيض الظهاري هو الورم الخبيث الأكثر فتكا خاص بأمراض النساء في الولايات المتحدة. على الرغم من أن المرضى يستجيبون في البداية إلى المعيار الحالي لرعاية تتكون من debulking الجراحي والعلاج الكيميائي تتكون من مزيج من البلاتين والتاكسين المركبات، ما يقرب من 90٪ من المرضى تتكرر في غضون بضع سنوات. في هؤلاء المرضى تطور المرض chemoresistant يحد من فعالية العلاج الكيميائي المتوفرة حاليا وبالتالي يساهم في ارتفاع معدل الوفيات. لاكتشاف خيارات العلاج الجديدة التي يمكن أن تستهدف الأمراض المتكررة، ويطلب النماذج الحيوانية المناسبة التي تحاكي بشكل وثيق على الملف الطبي للمرضى الذين يعانون من سرطان المبيض المتكررة. التحدي في مراقبة (IP) داخل الصفاق المرض يحد من استخدام نماذج الملكية الفكرية وتحت الجلد ومن ثم يتم وضع معظم xenografts. قمنا بتطوير منصة التصوير الضوئية الحساسة التي تسمح للكشف والمكان التشريحي للكتلة الورم الملكية الفكرية. وتشمل منصة يوذاتها من الصحفيين الضوئية التي تمتد من حدود الضوء المرئي لتقترب من الأشعة تحت الحمراء، والتي في تركيبة مع 2-الأبعاد الأشعة السينية المشارك التسجيل يمكن أن توفر المكان التشريحي للإشارات الجزيئية. وتحسنت بشكل ملحوظ الكشف عن طريق استخدام نظام التناوب الذي يدفع الحيوان إلى مواقف متعددة الزوايا لتصوير 360 درجة، مما يتيح تحديد الأورام التي تكون غير مرئية في اتجاه واحد. توفر هذه المنصة نموذجا فريدا لغير جراحية نمو الورم رصد وتقييم فعالية علاجات جديدة للوقاية أو العلاج من سرطان المبيض المتكررة.
Introduction
النماذج الحيوانية هي أدوات لا غنى عنها في بحوث علوم الحياة. في السرطان خاصة، وبيانات تم الحصول عليها من الدراسات على الحيوانات وتوفر المعلومات اللازمة للشروع في اختبار التطبيقات التشخيصية أو العلاجية الجديدة في البشر 1-3. يتم وضع نماذج حيوانية لسرطانات الصلبة كلاسيكي تحت الجلد، حيث أنه يوفر وسيلة سهلة لقياس عبء الورم وتقييم فعالية العلاج دون الحاجة للتضحية الحيوانات. في الواقع، تتطلب داخل الصفاق (IP) نماذج الحيوانات التي يمكن التضحية لكشف وقياس أي تغيرات في نمو الورم. ومع ذلك، لسرطانات الملكية الفكرية مثل سرطان المبيض، ونماذج المتعامدة التغاير توفر ميزة دراسة المرض في البيئة المناسبة لها 4-6. لمثل هذا النموذج لتكون ذات فائدة في تقييم النشاط المضادة للورم، بحاجة الى طرق التصوير غير الغازية لتكون المتقدمة التي تسمح الكمي لعبء IP الورم في الفئران الحية.
ويتمثل التحدي الرئيسي فياستخدام النماذج الحيوانية IP هو صعوبة في قياس بدقة عبء الورم عن طريق الفحص البدني. الكمي الدقيق للأورام الملكية الفكرية تتطلب عادة الفئران لا بد من التضحية للتشريح. يتطلب هذا النهج استخدام عدد كبير من الحيوانات، والتي سيتم التضحية في نقاط زمنية مختلفة. بالإضافة إلى التكلفة، فإنه يدخل تقلب بيانات عالية بسبب الاختلافات الكامنة داخل كل حيوان. غير الغازية التصوير الضوئي في الجسم الحي يوفر نهجا أكثر ملاءمة لمراقبة عبء الورم الملكية الفكرية في الفئران الحية.
وتستخدم عدة طرق التصوير غير الغازية حاليا في الأبحاث ما قبل السريرية لرصد نمو الورم والاستجابة العلاجية. وتشمل هذه المقطعي المحوسب (CT) والموجات فوق الصوتية (US)، التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) والتصوير الضوئي مثل مضان وتلألؤ بيولوجي 7-12. CT هو عملية التصوير نقل الجمع بين الأشعة السينية وcomputتكنولوجيا إيه. وتنتج المقطع العرضي صورة أشعة الكشف عن فوتون ذات طاقة عالية، والذي يمر عبر الجسم مع سرعة مختلفة. الولايات المتحدة هو نوع من انعكاس الصورة، والتي ترسل الأصوات عالية التردد لخلق جسم الموجات الصوتية التي تنعكس مع سرعة مختلفة اعتمادا على كثافة الأنسجة ومعترف بها بواسطة الكمبيوتر لإنتاج صورة بصرية. MRI و PET هي طرائق التصوير الانبعاثات التي تستخدم الطاقة المغناطيسية والجسيمات النووية، على التوالي لإنتاج الصورة. التصوير بالرنين المغناطيسي يخلق المجال المغناطيسي القوي الذي يدفع الخلايا لإنتاج ترددات الراديو الخاصة بهم، والتي تستخدم لخلق صورة بينما يتطلب PET كاميرا حساسة للكشف عن النشاط الإشعاعي لتدار المسمى 7،9،11 2-fluorodeoxy-D-الجلوكوز. أخيرا، ويستند التصوير الضوئي على الكشف عن الضوء انبعاث للصحفيين أو تحقيقات 9،12 إضاءة الحيوية أو الفلورسنت.
في هذا التقرير، وصفنا استخدام مضان، والتي تقدمبعض المزايا على أنواع أخرى من طرائق التصوير. مع التصوير مضان، يمكن للخلايا أن يكون وراثيا في التعبير عن البروتينات الفلورية باستمرار دون الحاجة إلى إضافة طبقة سفلية أو تحقيقات القائم على الربط، والتي هي المطلوبة لتلألؤ بيولوجي والتصوير بالرنين المغناطيسي، على التوالي. للصحفيين مضان أيضا عادة التعبير عن إشارة أكثر إشراقا مما يتيح استخدام طريقة الكشف أقل حساسية 8،12. بالإضافة إلى ذلك، مع التصوير مضان، فمن الممكن للكشف عن أورام أصغر من 1 سم، وهو ما لا يمكن تحقيقه مع CT 7-9. أخيرا، وعلى النقيض من تلألؤ بيولوجي، إشارة مضان لا يتطلب بيئة الهوائية، وبالتالي الإشارة لا يقتصر في بيئات ميتة، والتي عادة ما تحدث في النوى من الأورام الكبيرة 13.
ومع ذلك، مثل أي تكنولوجيا أخرى، على أساس أساليب التصوير فلوري بوجود سلبياته. واحد منها هو عدم قدرة ماشيالفوتونات المتولدة شمال شرق الطاقة منخفضة لتخترق إلى عمق كاف. وبالتالي، لتقليل كمية الأنسجة تنتشر الفوتونات يجب أن تصوير الحيوانات في زوايا مختلفة. وصفنا بروتوكول لإنشاء سرطان المبيض في الفئران عارية الملكية الفكرية والملكية الفكرية نهجا لمراقبة الورم الذي يوفر التصوير الحيوان كله من خلال التناوب. ومحور دوار زوايا الماوس لمواقف محددة وقابلة للتكرار تقليل تدخل الأنسجة التي غالبا ما يحدث بين مصدر الضوء وكاشف. هذا يحسن التصور الأورام الصغيرة التي قد خلاف ذلك ينبغي تفويتها.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفنا بروتوكول لإنشاء نموذج حيواني سرطان المبيض البشري IP الذي يحاكي التعريف السريري لوحظ في المرضى. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف استخدام جهاز دوران الحيوان الذي يتناول الحد من حساسية 2D التصوير. أخذت معا، يمكن لهذه التقنيات بمثابة منصات لاكتشاف مركبات جديدة يمكن أن تستهدف سرطان المبيض المتكررة chemoresistant. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النموذج يمكن استخدامه لفهم البيولوجيا من تكرار السرطان والتقدم.
نظرا لموقعه خلف الصفاق، في مرحلة مبكرة الملكية الفكرية xenografts سرطان المبيض تكاد تكون مستحيلة للكشف عن طريق فحص جسديا الماوس. في معظم الحالات، مرة واحدة ويمكن تحسس هذا المرض، وعبء الورم كبيرا بالفعل، وبالتالي يحد من تقييم فعالية العلاج. استخدام الخلايا fluorescently المسمى يسمح لنا بتقييم إنشاء IP الورم في الوقت الحقيقي، وبالتالي تحديد الوقت الأمثل لبدء رreatment. بطريقة مماثلة، xenografts الفلورسنت المسمى تتيح رصد الاستجابة للعلاج. وتجدر الإشارة، إلى أنه ومع ذلك الأورام التي IP أعمق من 1 سم وعادة ما تكون لا يمكن اكتشافها بغض النظر عن نظام المراسل.
استخدام خلايا سرطان المبيض الجذعية البشرية 14،15،17،22 يولد xenografts التي تحاكي التعريف السريري لوحظ في المرضى. كمرض الابتدائية، والنموذج هو استجابة لباكليتاكسيل لكن وقف العلاج يؤدي في النهاية إلى المرض المتكرر chemoresistant. إدخال الخلايا من خلال أبواق الرحم في الكثافة المحددة في القسم بروتوكول عادة ما يؤدي إلى أورام المبيض في غضون 10 أيام مع عدد قليل من يزرع البريتوني، وبالتالي يقلد المرض في مرحلة مبكرة. استخدام الخلايا fluorescently المسمى يسمح لنا بتقييم إنشاء IP الورم في الوقت الحقيقي، وبالتالي تحديد الوقت الأمثل لبدء العلاج. بطريقة مماثلة، xenografts الفلورسنت المسمى تسمح برصد سو استجابة للعلاج. في حالة استخدام أنواع أخرى من خطوط الخلايا السرطانية، المبيض أو غير ذلك، فمن الممكن أن هذا الملف قد لا يمكن ملاحظتها. عند استخدام SKOV3 على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن أن الأورام الأولية الملكية الفكرية هي مقاومة 23 بالفعل. ومع ذلك، إذا وصفت مع مراسل مثل مضان، والملكية الفكرية، المرض يمكن أن تتبع في الوقت الحقيقي.
إذا تم استخدام الآخرين مراسل الفلورسنت، فمن المهم إجراء التصوير الأولي مع جهاز تحكم (أي ورم) الحيوان. هذا سيسمح تعظيم الاستفادة من بروتوكول التصوير لتحقيق أفضل خلفية للإشارة إلى النسبة. في تجربتنا، والفئران عارية وعادة ما يكون خلفية عالية عند تصويرها باستخدام الإعدادات اكتساب GFP.
من المهم أن حقن الخلايا داخل الرحم ويتم في تعليق واحد لتجنب إنشاء أورام في الرحم. من المهم أيضا لتجنب خدش الطبقة الظهارية الرحم، مما يسهل أيضا engraftment من الخلايا السرطانيةS في الرحم مما ينتج ورم داخل الرحم بدلا من المرض الملكية الفكرية. بالإضافة إلى ذلك، خلال تحليل البيانات، من المهم تعيين قيمة جاما إلى 1. هذا يضمن أن كثافة الصور بشكل طولي وتتيح المقارنة بين الصور.
خلال اقتناء الصور MARS، فمن المهم التأكد من أن نهاية أنبوبية من الرؤوس لطي هي في عطلة الرؤوس. يخدم الرؤوس كنقطة اتصال للماوس، وبالتالي هناك حاجة للحصول على زوايا محسوبة بدقة. لبروتوكولات التصوير أطول (أي أطول من 1 ساعة)، وضخ 100 ميكرولتر من محلول ملحي معقم تحت الجلد للمساعدة على منع الجفاف. ينبغي الحفاظ على درجة حرارة الجسم الحيواني باستخدام الهواء الدافئ تدفقت من خلال نظام في حوالي 37 درجة مئوية. وجود قيود على نظام MARS هو أن حيوان واحد فقط ولا يمكن تصوير في وقت واحد مع وقت التشغيل الكلي لحوالي 1 ساعة لكل حيوان.
في الختام، نحن تصف مؤسسةablishment من نموذج حيواني الذي يحاكي بشكل وثيق بسرطان المبيض، وكلاهما المرض الأولية والمتكررة. هذا النموذج يمكن استخدامها لتقييم فعالية طرائق تشخيصية أو علاجية جديدة.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح RO1CA118678 وRO1CA127913، من قبل مؤسسة عائلة رمال، واكتشاف علاج للبرنامج.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
| T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
| 1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
| synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
| tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
| surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
| surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
| hemostat | VWR | 82027-422 | |
| Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
| Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5ml) | |
| Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
| In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
| MI software | Bruker Corporation | ||
| athymic nude mice | Harlan |
参考文献
- Cho, K. R. Ovarian cancer update: lessons from morphology, molecules, and mice. Archives of pathology & laboratory medicine. 133, 1775-1781 (2009).
- Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: are they the same?–Implications in cancer translational research. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 51, 501-504 (2010).
- Langdon, S. P. Animal modeling of cancer pathology and studying tumor response to therapy. Current drug targets. 13, 1535-1547 (2012).
- Mullany, L. K., Richards, J. S. Minireview: animal models and mechanisms of ovarian cancer development. Endocrinology. 153, 1585-1592 (2012).
- Ricci, F., Broggini, M., Damia, G. Revisiting ovarian cancer preclinical models: implications for a better management of the disease. Cancer treatment reviews. 39, 561-568 (2013).
- Pizzonia, J., et al. Multimodality animal rotation imaging system (Mars) for in vivo detection of intraperitoneal tumors. Am J Reprod Immunol. 67, 84-90 (2012).
- House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. Recent Technological Advances in Using Mouse Models to Study Ovarian Cancer. Frontiers in oncology. 4, 26 (2014).
- Rao, J., Dragulescu-Andrasi, A., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Current opinion in biotechnology. 18, 17-25 (2007).
- Manegold-Brauer, G., Bellin, A. K., Tercanli, S., Lapaire, O., Heinzelmann-Schwarz, V. The special role of ultrasound for screening, staging and surveillance of malignant ovarian tumors: distinction from other methods of diagnostic imaging. Archives of gynecology and obstetrics. 289, 491-498 (2014).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 49, 103-115 (2008).
- Rockall, A. G., et al. Repeatability of Quantitative FDG-PET/CT and Contrast-Enhanced CT in Recurrent Ovarian Carcinoma: Test-Retest Measurements for Tumor FDG Uptake, Diameter, and Volume. Clin Cancer Res. 20, 2751-2760 (2014).
- Hickson, J. In vivo optical imaging: preclinical applications and considerations. Urologic oncology. 27, 295-297 (2009).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annual review of biomedical engineering. 4, 235-260 (2002).
- Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
- Alvero, A. B., et al. Stem-like ovarian cancer cells can serve as tumor vascular progenitors. Stem Cells. 27, 2405-2413 (2009).
- Alvero, A. B., et al. NV-128, a novel isoflavone derivative, induces caspase-independent cell death through the Akt/mammalian target of rapamycin pathway. Cancer. , (2009).
- Chefetz, I., et al. TLR2 enhances ovarian cancer stem cell self-renewal and promotes tumor repair and recurrence. Cell Cycle. 12, 511-521 (2013).
- Liu, M., et al. High frequency of putative ovarian cancer stem cells with CD44/CK19 coexpression is associated with decreased progression-free intervals in patients with recurrent epithelial ovarian cancer. Reprod Sci. 20, 605-615 (2013).
- Steffensen, K. D., et al. Prevalence of epithelial ovarian cancer stem cells correlates with recurrence in early-stage ovarian cancer. J Oncol. 2011, 620523 (2011).
- Craveiro, V., Yang-Hartwich, Y., Holmberg, J., Sumi, N., Pizzonia, J., Griffin, B., Gill, S., Silasi, D., Azodi, M., Rutherford, T., Alvero, A. B., Mor, G. Phenotypic Modifications in Ovarian Cancer Stem Cells Following Paclitaxel Treatment. Cancer Medicine. , (2013).
- Kuroda, H., Marino, M. P., Kutner, R. H., Reiser, J., et al. Production of lentiviral vectors in protein-free media. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino..[etal.]. 26, (2011).
- Yin, G., et al. Constitutive proteasomal degradation of TWIST-1 in epithelial-ovarian cancer stem cells impacts differentiation and metastatic potential. Oncogene. 32, 39-49 (2013).
- Vassileva, V., Allen, C. J., Piquette-Miller, M. Effects of sustained and intermittent paclitaxel therapy on tumor repopulation in ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 7, 630-637 (2008).
