We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.
Epitheliale eierstokkanker is de meest dodelijke gynaecologische maligniteit in de Verenigde Staten. Hoewel patiënten in eerste instantie reageren op de huidige standaard van zorg die bestaat uit chirurgische debulking en combinatie chemotherapie bestaande uit platina en taxaanverbindingen, bijna 90% van de patiënten terugkeren binnen een paar jaar. Bij deze patiënten de ontwikkeling van chemoresistente ziekte beperkt de effectiviteit van de momenteel beschikbare chemotherapeutische middelen en derhalve bijdraagt tot de hoge mortaliteit. Om nieuwe therapie opties die terugkerende ziekte kunnen richten ontdekken, zijn geschikte dierlijke modellen die na te bootsen het klinische profiel van patiënten met terugkerende eierstokkanker nodig. De uitdaging controle intraperitoneale (ip) ziekte beperkt het gebruik van ip modellen en dus het meest xenotransplantaten gevestigd subcutaan. We hebben een gevoelige optische imaging platform dat de detectie en de anatomische locatie van ip tumormassa laat ontwikkeld. Het platform omvat de use optische reporters die zich uitstrekken van het zichtbare licht tot nabij infrarood, die in combinatie met 2-dimensionale röntgen coregistratie anatomische locatie van moleculaire signalen kunnen verschaffen. Detectie wordt aanzienlijk verbeterd door het gebruik van een systeem dat hierbij het dier meerdere hoekposities 360 graden beeldvorming drijft, waardoor de identificatie van tumoren die niet zichtbaar zijn in één richting zijn. Dit platform biedt een uniek model voor niet-invasieve tumorgroei controleren en evalueren van de effectiviteit van nieuwe therapieën voor de preventie of behandeling van recidiverende eierstokkanker.
Diermodellen zijn onmisbare hulpmiddelen in life science onderzoek. Bij kanker in het bijzonder, de gegevens verkregen uit dierproeven zorgen voor de nodige informatie over het testen van nieuwe diagnostische of therapeutische toepassingen bij de mens 1-3 initiëren. Diermodellen voor vaste kankers zijn klassiek vastgesteld subcutaan omdat het een gemakkelijke manier om tumorlast effectiviteit van de behandeling te meten en te evalueren zonder de dieren offeren. Inderdaad, intraperitoneale (ip) modellen maken dieren opgeofferd ter detectie en meting veranderingen in tumorgroei. Voor ip kankers zoals eierstokkanker, orthotroop modellen bieden het voordeel van het bestuderen van de ziekte in de juiste omgeving 4-6. Voor een dergelijk model voor gebruik in de evaluatie van anti-tumor activiteit, moeten niet-invasieve beeldvorming te ontwikkelen dat kwantificering van ip tumorlast in levende muizen mogelijk.
Een belangrijke uitdaging in degebruik van ip diermodellen is de moeilijkheid in het nauwkeurig kwantificeren tumorbelasting door lichamelijk onderzoek. Kwantificatie van ip tumoren vereisen gewoonlijk de muizen worden opgeofferd voor dissectie. Deze benadering vereist het gebruik van grote aantal dieren dat zou worden opgeofferd op verschillende tijdstippen. Naast de kosten, introduceert hoge data variabiliteit gevolg van inherente variaties binnen elk dier. Niet-invasieve in vivo optische beeldvorming zorgt voor een meer passende aanpak te monitoren ip tumorbelasting in levende muizen.
Verschillende niet-invasieve beeldvorming methoden worden momenteel gebruikt in pre-klinisch onderzoek voor de monitoring van tumorgroei en de therapeutische respons. Deze omvatten computertomografie (CT), ultrageluid (US), magnetische resonantie beeldvorming (MRI), positron emissie tomografie (PET), en optische beeldvorming zoals fluorescentie en bioluminescentie 7-12. CT is een transmissie imaging proces combineren X-ray en computre technologie. Het produceert een dwarsdoorsnede afbeelding van gedetecteerde balken hoogenergetische fotonen die door het lichaam met verschillende snelheid passeert. VS is een soort reflectie beeld, dat stuurt de hoge frequenties die aan het lichaam creëren geluidsgolven die worden gereflecteerd met verschillende snelheden, afhankelijk van tissue dichtheid en herkend door de computer om een visueel beeld te produceren van. MRI en PET zijn emissie beeldvormende modaliteiten die magnetische energie en nucleaire deeltjes te gebruiken, respectievelijk om het beeld te produceren. MRI maakt een sterk magnetisch veld dat cellen induceert hun eigen radiofrequenties, die worden gebruikt om een beeld te creëren produceren terwijl PET is een gevoelig camera om de radioactiviteit van de gemerkte toegediend 2-fluorodeoxy-D-glucose 7,9,11 detecteren. Tenslotte wordt optische beeldvorming gebaseerd op de detectie van de emissie van licht bioluminescente of fluorescente reporters of probes 9,12.
In dit rapport beschrijven we het gebruik van fluorescentie, dat biedtenkele voordelen boven andere soorten beeldvormende modaliteiten. Met fluorescentie beeldvorming, kunnen cellen genetisch gemanipuleerd om fluorescerende eiwitten tot expressie voortdurend zonder de toevoeging van een substraat of ligatie probes die voorwaarde voor respectievelijk bioluminescentie en magnetische resonantie beeldvorming, zijn. Fluorescentie reporters ook typisch drukken een helderder signaal waardoor het gebruik van een minder gevoelige detectiemethode 8,12. Bovendien, met fluorescentie beeldvorming, is het mogelijk om tumoren kleiner dan 1 cm, hetgeen niet haalbaar CT 7-9 detecteren. Tenslotte, in tegenstelling tot bioluminescentie, fluorescentie signaal niet een aërobe omgeving vereisen en dus het signaal niet beperkt hypoxische omstandigheden, die gewoonlijk plaatsvinden in de kernen van grote tumoren 13.
Echter, zoals elke andere technologie, TL-based imaging methoden zijn nadelen. Een daarvan is het onvermogen van de machine-generated laag energetische fotonen door te dringen tot een voldoende diepte. Dus de hoeveelheid verspreide fotonen weefsel de dieren worden afgebeeld onder verschillende hoeken te minimaliseren. We beschrijven een protocol om een ip eierstokkanker in naakt muizen en een aanpak voor ip tumor controle dat hele dier beeldvorming biedt door rotatie vast te stellen. De rotator hoeken de muis om specifieke en herhaalbare posities verminderen van de weefsel storing die vaak optreedt tussen de lichtbron en de detector. Dit optimaliseert de visualisatie van kleinere tumoren die anders worden gemist.
We beschrijven een protocol om een ip menselijke eierstokkanker diermodel dat het klinische profiel waargenomen bij patiënten nabootst vestigen. Verder beschrijven we het gebruik van een dier rotatie-inrichting die de gevoeligheid beperking van 2D imaging adressen. Tezamen kunnen deze technieken dienen als platforms om nieuwe verbindingen die chemoresistent terugkerende eierstokkanker kunnen richten ontdekken. Bovendien kunnen dergelijke model worden gebruikt om de biologie van kanker recidief en progressie begrijpen.
Door zijn retroperitoneale locatie, in een vroeg stadium ip eierstokkanker xenograften zijn bijna onmogelijk te detecteren door fysiek onderzoek van de muis. In de meeste gevallen, wanneer de ziekte kan worden gepalpeerd, de tumorlast reeds aanzienlijk en derhalve beperkt de therapie-effect. Het gebruik van fluorescent gelabelde cellen ons toelaat om de oprichting van ip tumor te evalueren in real time en dus het identificeren van de optimale tijd om te beginnen met tehandeling. Op soortgelijke wijze, fluorescent gelabelde xenotransplantaten laten volgen van respons op behandeling. Opgemerkt-echter dat ip tumoren dieper dan 1 cm zijn meestal niet detecteerbaar ongeacht het reportersysteem.
Het gebruik van menselijke eierstokkanker stamcellen 14,15,17,22 genereert xenograften dat het klinische profiel waargenomen bij patiënten na te bootsen. Als een primaire ziekte, het model reageert op Paclitaxel maar stopzetting van de behandeling uiteindelijk tot chemoresistent terugkerende ziekte. Introductie van de cellen door de baarmoederhoorns op de dichtheid opgegeven in het Protocol resulteert meestal in ovariële tumoren binnen 10 dagen met een paar peritoneale implantaten, en dus bootst een vroeg stadium van de ziekte. Het gebruik van fluorescent gelabelde cellen ons toelaat om de oprichting van ip tumor te evalueren in real-time en dus het identificeren van de optimale tijd om te beginnen met de behandeling. Op soortgelijke wijze, fluorescent gelabelde xenotransplantaten mogelijk controle of respons op de behandeling. Indien andere vormen van kanker cellijnen worden gebruikt, ovarium- of anders is het mogelijk dat dit profiel niet worden waargenomen. Wanneer SKOV3 wordt bijvoorbeeld gebruikt, is gerapporteerd dat het eerste ip tumoren al resistent 23. Indien echter gemerkt met een reporter zoals fluorescentie, ip, ziekte te volgen in real-time.
Als andere fluorescerende reporter wordt gebruikt, is het belangrijk initiële beeldvorming voeren met een controle (geen tumor) dieren. Dit zal optimalisatie van imaging protocol om de beste achtergrond om de verhouding signaal te bereiken. In onze ervaring, naakt muizen hebben doorgaans een hoge achtergrond wanneer afgebeeld met behulp van de GFP overname instellingen.
Het is belangrijk dat cellen intra-uteriene worden in enkele ophanging de vestiging van tumoren in de uterus voorkomen. Het is ook belangrijk om te voorkomen krassen de baarmoeder epitheellaag, die ook vergemakkelijkt enting van de kankercels in de baarmoeder waardoor aldus een intra-uterine tumor in plaats van een ip ziekte. Bovendien, tijdens data-analyse is het belangrijk om de gammawaarde 1. Dit zorgt ervoor dat de intensiteit van de beelden is lineair en maakt vergelijking tussen afbeeldingen instellen.
Tijdens de overname van MARS beelden, is het belangrijk dat de snowtuben einde van de inklapbare neuskegel is in de neuskegel uitsparing. De neuskegel dient als aanspreekpunt voor de muis en is daarom verplicht voor het verkrijgen van nauwkeurig gekalibreerd hoeken. Voor langere beeldvormingsprotocollen (bijvoorbeeld langer dan 1 uur), injecteer 100 ul steriele zoutoplossing subcutaan om uitdroging te voorkomen. Dier lichaamstemperatuur te handhaven met warme lucht doorstroomd het systeem bij ongeveer 37 ° C. Een beperking van het MARS systeem is dat slechts één dier kan worden afgebeeld op een tijd met een totale looptijd van ongeveer 1 uur per dier.
Concluderend, beschrijven we het establishment van een diermodel dat nauw bootst eierstokkanker, zowel primair als terugkerende ziekte. Dit model kan worden gebruikt om de doeltreffendheid van nieuwe diagnostische en therapeutische modaliteiten evalueren.
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd ondersteund door NIH subsidies RO1CA118678 en RO1CA127913, door de Sands Family Foundation, en de Discovery naar Program Cure.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
hemostat | VWR | 82027-422 | |
Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5ml) | |
Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
MI software | Bruker Corporation | ||
athymic nude mice | Harlan |