Une enzyme de restriction basée sur le clonage méthode pour évaluer la<em> In vitro</em> Capacité de réplication du VIH-1 sous-type C Gag-MJ4 chimériques virus

Déterminer à la fois l'hôte et des caractéristiques virales qui influent sur le VIH-1 pathogenèse et la progression de la maladie est primordiale pour la conception rationnelle de vaccins. La réponse immunitaire cellulaire est un élément clé de la réponse immunitaire humaine au VIH-1 infection. Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) sont nécessaires pour le contrôle initial de la virémie aiguë, et permettent à l'hôte d'établir un état ​​stable (point de consigne) de la charge virale ^{de 1,2.} Épuisement expérimentale de ces cellules effectrices en résulte une perte de contrôle viral ^3,4. Malgré cela, les mutations se produisent à l'intérieur de s'échapper du génome viral qui renverser CTL reconnaissance des cellules infectées par des virus ^9.5.

Certains allèles HLA ont été associés à une charge virale plus faibles et plus lente progression de la maladie, y compris 57 * B, B * et B * 27 81 ^{10 à 15.} Une partie de l'effet protecteur des allèles HLA de classe I peut être attribué au fait qu'ils ciblent les régions fonctionnellement limitées du génome tels que Gaget pour sélectionner des mutations d'échappement qui diminuent la capacité du virus à se répliquer in vitro ^{de 16 à 21.} Bien évasion du système immunitaire cellulaire est bénéfique pour le virus dans le contexte de la classe de sélection de l'allèle HLA I, l'effet de ces mutations peut avoir des conséquences différentielles de l'hôte lors de la transmission d'un individu HLA-incompatibles ^22,23. Par conséquent, la compréhension des effets des mutations transmises évacuation de HLA-associé sur la capacité de réplication virale sera important d'approfondir notre compréhension de début de la pathogenèse du VIH-1.

Bien que beaucoup de progrès ont été faits pour identifier et caractériser les défauts de remise en forme de mutations d'échappement individuelles associées à HLA de classe spécifique je allèles ^24-29, naturellement isolats VIH-1 ont des empreintes uniques et complexes de polymorphismes HLA-associé, probable découlant de l'HLA pression immunitaire médiée par des milieux différents immunogénétiques ^30. En apanalyse revious, Goepfert et al. a montré que l'accumulation de mutations HLA-associés dans les séquences Gag transmissibles provenant de 88 Zambiens infection aiguë a été associée à une réduction de la valeur de consigne de la charge virale ^31. Ceci suggère que la transmission de mutations délétères d'échappement, en particulier dans Gag, à des destinataires HLA-incompatibles fournit un bénéfice clinique, et peut être dû à la réplication virale atténuée. Aller de l'avant, il est impératif d'étudier la complexité des combinaisons de polymorphismes Gag dans les isolats naturels travaillent de concert pour définir les caractéristiques du virus transmissibles telles que la capacité de réplication et de la réplication précoce pourrait à son tour affecter le VIH-1 paramètres cliniques et à un stade avancé pathogenèse.

Brockman et al. D'abord démontré un lien entre la capacité de réplication des séquences gag-pro isolé lors de l'infection de stade chronique et la charge virale dans les deux sous-type C et les infections B32-35. L'approche expérimentale présentée dans ces études, bien approprié pour l'examen de la capacité de réplication in vitro de séquences provenant d'individus infectés de manière chronique, présente plusieurs réserves techniques et des limitations qui rendent l'étude du VIH-1 sous-type à capacité réplicative C individus infectés aiguë difficile. Cette méthode repose sur la recombinaison de séquences amplifiées par PCR basée sur la population dans le sous-type B NL4-3 provirus, qui a été dérivé en partie de VBL, un laboratoire adapté stock de virus ^36. génération du virus a été réalisée par co-transfection d'une lignée de cellules T CEM à base ³⁷ avec des amplicons PCR et digéré delta NL4-3 ADN de gag-pro. Cette méthode nécessite l'excroissance du virus au cours d'une période de plusieurs semaines à plusieurs mois, ce qui pourrait fausser la nature du stock de virus récupérée par rapport à la quasi-espèce virale in vivo, et en modifiant par conséquent la mesure de la capacité de réplication in vitro. Cette méthode is plus approprié pour étudier les individus infectés de manière chronique, où il sélectionne de manière efficace contre le virus de la capacité réplicative plus élevé, et où le clonage de nombreux différents variants viraux à partir d'un grand nombre d'individus infectés de manière chronique est très laborieuse et donc non réalisable. Cependant, au sein d'une personne gravement infectée, il ya généralement de un à deux variantes présent, et éliminant ainsi le risque de biaiser la nature du stock de virus récupéré, grâce à des pressions de sélection in vitro, permet une évaluation plus précise de vitro la capacité à la réplication. Deuxièmement, cette méthode nécessite recombiner sous-type C séquences gag-pro dans un squelette dérivé sous-type B, et pourrait introduire squelette biais d'incompatibilité dans l'analyse. En raison de ces limitations, un grand nombre de séquences doivent être analysés afin de surmonter les biais potentiels introduits.

Nous décrivons ici une appro expérimental alternatifhaque approprié pour étudier des séquences dérivées de sous-type C personnes infectées de façon aiguë. Nous utilisons une stratégie de clonage basé sur des enzymes de restriction pour introduire le gène gag provenant de points de VIH-1 sous-type C individus infectés temps de l'infection aiguë dans le proviral épine dorsale sous-type C, MJ4. L'utilisation de MJ4 comme une épine dorsale qui en commun pour cloner les gènes gag est crucial pour l'analyse de sous-type C de séquences dérivées. MJ4 est issu d'un isolat primaire ^38, et seraient donc moins susceptibles d'introduire un biais en raison de sous-type incompatibilité entre la colonne vertébrale et le gène gag. De plus, l'approche de clonage en utilisant l'enzyme de restriction sur la base permet la proviral construit pour être directement transfectées dans des cellules 293T, et pour la récupération d'un stock de virus clonal identique à la séquence gag clone.

Le procédé présenté ci-dessous est un procédé à haut débit pour évaluer la capacité de réplication de sous-type C provenant Gag-MJ4les virus chimériques. La transfection dans des cellules 293T est simple et la récupération de virus ne prend que trois jours. In vitro la capacité de réplication est analysée sur la même lignée de cellules T à base de CEM-CCR5 créé par Brockman et al. ^37, mais en utilisant des modifications du protocole importants nécessaires à la replication réussie des sous-types des virus chimériques C MJ4. L'utilisation d'une lignée de cellules T approprié plutôt que de PBMC permet à un grand nombre de virus de sous-type chimérique MJ4-C à tester avec une grande reproductibilité test. Enfin, en utilisant un dosage radio-marqué de la transcriptase inverse pour la quantification du virus dans le surnageant est plus économique que l'utilisation des kits ELISA disponibles dans le commerce p24. Il donne également une gamme dynamique plus élevée, ce qui était important pour détecter les virus faiblement et hautement répliquant dans le même dosage et pour détecter des différences subtiles dans la réplication entre les isolats.

En conclusion, la méthode présentée ici a permis del'étude approfondie de la capacité de réplication des séquences gag dérivés du VIH-1 sous-type C infection aiguë individus de la Zambie, et comme il est écrit, pourrait aussi être élargie pour étudier d'autres sous-type C infecté populations. Un haut degré de variation dans les capacités de réplication entre les différents isolats Gag a été observée. En outre, nous avons pu montrer une association statistique entre la capacité de réplication du Gag transmis et la consigne de la charge virale ainsi que des CD4 + baisse sur une période de trois ans ^39. Ces résultats soulignent l'importance d'étudier les caractéristiques virales faire transmis, tels que la capacité de réplication, interagissent avec le système immunitaire de l'hôte d'influencer la pathogenèse lors de l'infection précoce et feront partie intégrante de l'élaboration d'interventions efficaces de vaccination ainsi que le traitement.