Un enzima di restrizione metodo basato clonazione per valutare l'<em> In vitro</em> Replica Capacità di HIV-1 Sottotipo C Gag-MJ4 chimerici virus

Determinare l'host e le caratteristiche virali che influenzano HIV-1 patogenesi e nella progressione della malattia è fondamentale per la progettazione razionale di vaccini. La risposta immunitaria cellulare è un componente chiave della risposta immunitaria umana HIV-1. Linfociti T citotossici (CTL) sono necessari per il controllo iniziale della viremia acuta, e permettono l'host di stabilire uno stato di equilibrio (set point) carica virale ^1,2. Deplezione sperimentale di queste cellule effettrici si traduce in perdita di controllo virale ^3,4. Nonostante questo, sfuggono le mutazioni sorgono all'interno del genoma virale che sovvertire CTL riconoscimento delle cellule infettate da virus ^5-9.

Alcuni alleli HLA sono stati associati con una carica virale inferiore e la progressione della malattia più lenta tra cui B * 57, B * 27 e B * 81 ^10-15. Parte del beneficio protettivo di alleli HLA di classe I può essere attribuito al fatto che esse mirano regioni funzionalmente vincolati del genoma come Gage selezionare per le mutazioni di fuga che riducono la capacità del virus di replicarsi in vitro ^16-21. Sebbene fuga dal sistema immunitario cellulare è vantaggioso per il virus nel contesto della classe I allele HLA selezione, l'effetto di queste mutazioni può avere conseguenze differenziali per l'host dopo la trasmissione a un HLA-non corrispondenti individuale ^22,23. Pertanto, la comprensione degli effetti delle mutazioni trasmesse fuga HLA-associato sulla capacità di replicazione virale sarà importante per migliorare la nostra comprensione dei primi HIV-1 patogenesi.

Sebbene siano stati compiuti molti progressi per identificare e caratterizzare i difetti di fitness di mutazioni di fuga individuali associati con particolare HLA di classe I alleli ^24-29, naturalmente HIV-1 isolati sono impronte uniche e complesse di polimorfismi HLA-associato, probabilmente derivanti dalla HLA pressione immunitaria mediata di diversa provenienza immunogenetici ^30. In apanalisi revious, Goepfert et al. ha dimostrato che un accumulo di mutazioni HLA-associati nelle sequenze Gag trasmessi derivate da 88 Zambians infezione acuta era associato ad una riduzione della carica virale set point ^31. Questo suggerisce che la trasmissione di mutazioni deleterie di fuga, in particolare in Gag, ai destinatari HLA-non corrispondenti fornisce un beneficio clinico, e può essere dovuto ad attenuare la replicazione virale. Andando avanti, è imperativo studiare come complesso combinazioni di polimorfismi Gag all'interno isolati naturali lavorano in concerto per definire le caratteristiche del virus trasmesso come la capacità di replicazione, e come la replicazione precoce potrebbe a sua volta influenzare HIV-1 parametri clinici e di fase tardo- patogenesi.

Brockman et al. Prima dimostrato un legame tra la capacità di replicazione di sequenze gag-pro isolato durante l'infezione fase cronica e la carica virale sia nel sottotipo C e le infezioni B32-35. L'approccio sperimentale presentato in questi studi, anche se adeguato per esaminare la capacità di replicazione in vitro di sequenze derivate da individui cronicamente infetti, ha diversi avvertimenti tecnici e limitazioni che rendere lo studio di HIV-1 capacità replicativa nel sottotipo C individui con infezione acuta difficile. Questo metodo si basa sulla ricombinazione di base di popolazione sequenze PCR-amplificate nel sottotipo B NL4-3 provirus, che è stato derivato in parte da LAV, un laboratorio adattato virus magazzino ^36. Generazione di virus è stato realizzato da co-trasfezione di una base-CEM linea di cellule T ³⁷ con ampliconi della PCR e digerito delta- NL4-3 DNA gag-pro. Questo metodo richiede l'escrescenza di virus in un periodo di settimane o mesi, potenzialmente alterando la natura del virus magazzino recuperati rispetto ai quasispecie virale in vivo, e quindi alterare la misurazione della capacità di replicazione in vitro. Questo metodo is più appropriato per studiare gli individui cronicamente infette, dove seleziona efficacemente per virus con la più alta capacità replicativa, e dove clonazione numerose varianti virali differenti da un gran numero di individui cronicamente infette è piuttosto intenso lavoro e quindi non fattibile. Tuttavia, all'interno di un individuo infetto acutamente, ci sono generalmente 01:59 varianti presenti, ed eliminando così il rischio di inclinazione della natura del virus magazzino recuperato, attraverso pressioni della selezione in vitro, consente una valutazione più accurata della capacità di replicazione in vitro. In secondo luogo, questo metodo richiede ricombinazione sottotipo C sequenze gag-pro in un sottotipo B dorsale derivato, e potrebbe introdurre distorsioni backbone incompatibilità nell'analisi. A causa di queste limitazioni, un gran numero di sequenze devono essere analizzati al fine di superare eventuali distorsioni introdotte potenziali.

Qui si descrive un appro sperimentale alternativaach appropriata per studiare le sequenze derivate dal sottotipo C individui con infezione acuta. Usiamo una strategia di clonazione basata enzima di restrizione per introdurre il gene gag derivato dal acuti momenti di infezione da HIV-1 sottotipo C individui infetti nella spina dorsale provirale sottotipo C, MJ4. L'uso di MJ4 come una spina dorsale comune in cui clonare i geni gag è cruciale per l'analisi di sottotipo C sequenze derivate. MJ4 è derivato da un isolato primario ^38, e quindi sarebbe meno probabilità di introdurre bias dovuto al sottotipo incompatibilità tra la spina dorsale e il gene gag. Inoltre, l'approccio di clonazione mediante restrizione basata enzima permette la provirale costruisce essere trasfettate direttamente nelle cellule 293T, e per il recupero di un virus magazzino clonale identica alla sequenza di gag clonata.

Il metodo presentato qui di seguito è un metodo ad alta produttività per la valutazione della capacità di replicazione del sottotipo C derivato Gag-MJ4virus chimerici. Trasfezione in cellule 293T è semplice e il recupero di virus richiede solo tre giorni. In vitro la capacità di replica viene analizzato sulla stessa base linea di T-cellule CEM-CCR5 creato da Brockman et al. ^37, ma con importanti modifiche di protocollo necessario per la replica di successo di sottotipo C MJ4 virus chimerici. L'utilizzo di una linea di T-cella appropriata piuttosto che PBMC permette un gran numero di sottotipo C virus MJ4-chimerico per essere testati con alto dosaggio riproducibilità. Infine, utilizzando un radiomarcato test trascrittasi inversa per la quantificazione del virus nel surnatante è più conveniente rispetto all'utilizzo di kit ELISA disponibile in commercio P24. Inoltre, dà una gamma dinamica superiore, che era importante per rilevare i virus male e altamente replicare all'interno dello stesso test e per la rilevazione di sottili differenze nella replica tra gli isolati.

In conclusione, il metodo qui presentato ha permessolo studio approfondito della capacità di replicazione di sequenze gag derivati ​​da HIV-1 sottotipo C acutamente infettato individui dallo Zambia, e come scritto, potrebbe anche essere esteso a studiare altri sottotipo C popolazioni infettato. È stato osservato un alto grado di variazione capacità di replica tra i diversi isolati Gag. Inoltre, siamo stati in grado di dimostrare un'associazione statistica tra la capacità di replicazione del Gag trasmessi e set point carica virale così come con CD4 + declino nel corso di un periodo di tre anni ^39. Tali risultati sottolineano l'importanza di studiare le caratteristiche virali come trasmesso, come la capacità di replica, interagiscono con il sistema immunitario ospite di influenzare patogenesi durante l'infezione precoce e saranno parte integrante per lo sviluppo di interventi di vaccini efficaci e trattamento.