在头颈部肿瘤组织中高危型HPV的存在是有利的结果有关。 原位杂交技术最近开发的RNA称为RNAscope允许的HPV E6/E7 mRNA在FFPE组织切片直接可视化。
对于致癌型HPV检测的“金标准”是肿瘤组织中转录活性的高危型HPV的示范。然而,检测E6/E7 mRNA的定量反转录聚合酶链反应(定量RT-PCR),需要RNA提取它破坏的形态相关的肿瘤组织方面至关重要,已经很难在常规的临床实践中被采纳。我们在原位杂交技术,RNAscope最近开发的RNA,允许在福尔马林固定,石蜡包埋(FFPE)组织与单分子灵敏度和单细胞分辨率,使高度敏感和特异的任何生物标记的RNA 原位分析的RNA直接可视化在日常临床标本。该RNAscope HPV检测的目的是检测七个高危HPV基因型采用基因型特异性探针池的E6/E7基因(HPV16,18,31,33,35,52,和58)。它具有卓越的灵敏度和特异性针对检测E6/E7 mRNA的定量RT-PCR检测目前的“金标准”方法。 HPV状态由RNAscope决定的强烈预后的口咽癌患者的临床疗效。
全世界1高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染占所有癌症的约5%。 HPV相关口咽癌的发病率在过去几十年有所增加,特别是男性。 HPV阳性口咽鳞状细胞癌(OPSCC)将有可能在未来20年2占了绝大多数所有头部和颈部癌症在美国。由人乳头瘤病毒引起口咽部鳞状细胞癌都与良好的生存相关,与肿瘤HPV状态是生存3一个强大而独立的预后因素。
对于病毒癌基因E6和E7的转录激活的证据被视为黄金标准临床相关的HPV 4的存在。然而,从通过RT-PCR技术的新鲜肿瘤组织的检测E6/E7 mRNA的是不实用的常规临床实践中,并已限定于研究实验室。最近,我们甲肝Ë开发了一种名为RNAscope一个新的RNA原位杂交技术,使多重检测单个细胞在福尔马林固定,石蜡包埋组织标本(FFPE)的5-10单个RNA分子的灵敏度。我们提供了三个方面的证据进行单分子检测5。首先,RNAscope探针设计和信号放大系统允许检测在HeLa细胞和SK-BR-3细胞系中单个拷贝的HER2基因组DNA的目标。第二,当与HER2基因组DNA的信号进行比较,在HeLa细胞中的HER2 mRNA的信号点的荧光强度的分布与每点一个分子中是一致的。第三,每个细胞的HER2 mRNA的信号点的数目相匹配密切通过基于溶液的定量测定法估计的HER2 mRNA的拷贝数,进一步支持单分子检测。此外,用DAPI细胞核在荧光显微镜或用苏木在明亮的视野显微镜的复染允许单个核的可视化,WHICH从而允许检测和RNA靶标量化对单细胞基础10。分析基因表达的原位在日常临床标本的能力,使得RNAscope一个有前途的平台,为病理诊断,尤其是那些FFPE组织部分为基础的检测10,11。我们已经开发了一个RNAscope为基础的HPV检测方法的采用基因型特异性探针池七个高风险HPV基因型(HPV16,18,31,33,35,52,和58)E6/E7 mRNA的表达。我们最近在OPSCC的研究表明,人乳头状瘤病毒RNAscope检测具有高度的敏感性和特异性在确定FFPE组织12-17 HPV状态,并且也告知预后OPSCC 12,16。
该RNAscope技术的原理以前已经描述5。在这里,我们描述了完整的RNAscope分析方案,并展示其在HR-HPV在FFPE肿瘤组织切片检测中的应用。
该RNAscope HPV检测允许E6/E7 mRNA的直接可视化原位 HPV相关的头颈部鳞状细胞癌。该RNAscope测定法是用常规固定的肿瘤组织完全相容,并保留组织形态进行组织病理学的相关性( 图2)。比传统CISH方法RNAscope测定的一个重要优点是,它特异性地扩增杂交信号( 图2B和2E)未经放大的背景噪声( 图2C和2F)。
在实践中,RNAscope HPV检测程序可以在8小时内完成,或方便地划分超过两天。该RNAscope HPV检测已经被用来确定HPV状态在头颈部鳞状细胞癌12-16,采用实时荧光定量PCR检测的参考方法16表明97%的敏感性和93%的特异性。常规字符omogenic ISH为高危型HPV DNA是非常具体的,但有80〜12%的敏感性。免疫组织化学(IHC)染色的细胞的替代标记p16蛋白表现出优异的灵敏度,但可能会产生假阳性结果15,18,特别是在nonoropharyngeal头部和颈部癌症15。定量RT-PCR检测HPV E6/E7 mRNA的检测目前的“金标准”方法需要新鲜冰冻组织达到最佳的效果,并在技术上是复杂的,这限制了它的使用只研究实验室。此外,它需要的RNA提取,这使得它不可能关联HR-HPV E6/E7 mRNA表达与组织病理学。
有几个关键因素的RNAscope试验的成功。第一,为了获得最佳结果,组织应在室温下放置16-32小时,根据ASCO / CAP指南19固定在新鲜的10%中性缓冲福尔马林中。其次,HybEZ烤箱强烈推荐,因为它使S温度和湿度探针杂交和信号放大步骤的优化控制。第三,以除去多余的残留缓冲区每个步骤之前,但仍然保持了组织切片的干燥过程中任何一个步骤是很重要的。
这里所描述的手动RNAscope程序已经完全自动化的商用幻灯片自动染色系统10。这应该极大地方便了实验条件,并在临床病理实验室节省了宝贵的体力劳动标准化。此外,专用的图像分析软件已经开发10自动识别的数字化幻灯片,这应该有助于消除主观性和提高可重复性在得分细胞和染色信号。
综上所述,RNAscope HPV检测检测高危型HPV E6/E7 mRNA转录原位存在的FFPE组织。它有一个工作流程,熟悉临床病理实验室保守党通过允许直接可视化这些组织切片。它提供了用于检查(FFPE)组织样品的理想平台,并且可以很容易地通过了诊断病理学实验室。
The authors have nothing to disclose.
由美国国立卫生研究院授予(R43/44CA122444)和国防部BRCP补助金(W81XWH-06-1-0682),以YL的部分支持。
SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit – Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16,18,31,33,35,52 and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
Cover Glass 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
Drying Oven | Capable of holding temperature at 60 ± 1°C | ||
Water Bath | Capable of holding temperature at 40 ± 1°C | ||