Nós já desenvolveu uma técnica para implantar fios tetrode no complexo central do cérebro de barata que nos permite monitorar a atividade em unidades individuais de baratas amarrados. Aqui apresentamos uma versão modificada do que a técnica que nos permite também gravar a atividade cerebral em insetos se movendo livremente.
O crescente interesse no papel de atividade cerebral no controle motor inseto exige que sejamos capazes de monitorar a atividade neural enquanto insetos executar o comportamento natural. Nós já desenvolveu uma técnica para implantar fios tetrode no complexo central do cérebro de barata que nos permitiram gravar a atividade de vários neurônios simultaneamente, enquanto uma barata amarrados virou velocidade de caminhada ou alterado. Enquanto um grande avanço, os preparativos amarrados fornecer acesso a comportamentos limitados e muitas vezes não têm os processos de feedback que ocorrem em animais movendo-se livremente. Apresentamos agora uma versão modificada do que a técnica que nos permite gravar a partir do complexo central da movendo-se livremente baratas como andam em uma arena e lidar com as barreiras, transformando, escalada ou tunelamento. Juntamente com o vídeo de alta velocidade e de corte cluster, agora podemos relacionar a atividade cerebral de vários parâmetros do movimento de insetos comportando livremente.
Este artigo descreve um sistema bem sucedido para a gravação de neurônios dentro do complexo central (CC) da barata, discoidalis Blaberus, como o inseto entra em uma arena e lida com objetos que fazem com que se virar, túnel sob, ou passar por cima de obstáculos. Os fios podem também ser ligados a um estimulador de evocar actividade no neuropil circundante, com as consequentes alterações comportamentais.
Na última década, considerável atenção tem sido direcionada para os papéis desempenhados por várias regiões do cérebro em controlar o comportamento de insetos. Grande parte desse foco foi direcionado para as neuropils cerebrais da linha média que são referidos coletivamente como o complexo central (CC). Registaram-se progressos, como resultado de uma ampla variedade de técnicas que visam questões sobre o papel do CC no comportamento. Essas técnicas variam de manipulações neurogenéticos, principalmente em Drosophila, juntamente com behavianálise oral, 1-3, a técnicas eletrofisiológicas que monitoram a atividade neural dentro do CC e tentativa de relacionar a atividade com os parâmetros comportamentais relevantes.
Técnicas eletrofisiológicas incluem gravação intracelular de neurônios individuais identificados 4-9 e gravação extracelular, muitas vezes com múltiplas sondas canal 10,11. Estas duas técnicas são gratuitos. Gravação intracelular com eléctrodos cortantes ou remendo célula completa fornece dados muito pormenorizados sobre neurónios identificados, mas está limitada a uma ou duas células ao mesmo tempo, requer pouco ou nenhum movimento, e pode ser mantido durante períodos relativamente curtos de tempo. Gravações extracelular pode ser facilmente configurado, não necessitam de restrição, e pode ser mantido por horas. Com tetrodes multicanal e corte cluster, bastante grandes populações de neurônios podem ser analisados simultaneamente 9,12. Enquanto PATC célula inteirah foi usado com sucesso em insetos amarrados 13, sentimos que há também uma necessidade de técnicas que nos permitem gravar a atividade neural no cérebro por longos períodos de tempo em se comportando livremente insetos como eles lidam com as barreiras ao movimento para a frente.
A necessidade de gravar como os insetos se move e salta para cima e para baixo nos empurrou em direção a métodos de gravação extracelulares. Tivemos sucesso em boa gravação preparações contido com comercialmente disponíveis sondas 16 canais de silício 11, no entanto, o tamanho pequeno do mesmo grandes baratas significa que as sondas têm de ser montados fora do corpo. Isso, juntamente com a delicadeza dos dentes sonda, fez uma preparação inadequada para andar livre. Em dois projetos anteriores, foram utilizados feixes de fios finos, formando uma tetrodo para realizar propriedades de gravação semelhantes, mas em um arranjo mais robusto. Estes pacotes tetrode nos permitiu gravar a partir de baratas amarrados umd relacionar atividade unidade CC às mudanças na velocidade de andar 14 e virando comportamento resultante do contato da antena com uma haste 10.
Por mais útil que estas preparações amarrados foram e continuarão a ser, eles apresentam algumas limitações. Em primeiro lugar, os comportamentos que o inseto pode executar são limitados a um avião. Ou seja, poderíamos facilmente evocar mudanças na velocidade de caminhada ou de viragem, mas as ações de escalada e túnel não fosse possível, pelo menos com o arranjo típico corda. Em segundo lugar, os preparativos estão amarrados "circuito aberto". Ou seja, eles não permitem o retorno normal de movimento relacionado ao sistema. Assim, como a barata ligado a corda, o mundo visual não foi alterado em conformidade. É possível construir sistemas de amarrar em malha fechada para introduzir este tipo de feedback. No entanto, eles são limitados pela complexidade da programação e de hardware do ambiente visual simulada. Nevertheless, sentimos que poderíamos melhorar nossos métodos de gravação amarrados existentes através da gravação a partir do animal, uma vez que andava livremente em uma arena ou pista e objetos encontrados como faria em seu ambiente natural.
Embora os sistemas sem fios para registo da actividade do cérebro 15 seria o ideal, os sistemas actuais têm limitações no número de canais de gravação, o tempo de aquisição de dados, a duração da bateria e do peso. Nós, portanto, optou por tentar adaptar o nosso sistema de gravação tethered para uso em preparações se movendo livremente. Como melhores sistemas sem fios tornar-se disponíveis, esta técnica pode ser facilmente adaptado a esses dispositivos. O sistema que é descrito neste artigo é leve, funciona muito bem e parece ter pouco efeito deletério sobre o comportamento da barata. Com uma câmara de alta velocidade e de baixo custo de software de corte de cluster, actividade em neurónios individuais do cérebro pode ser relacionada com o movimento. Aqui nós descrevemos a preparção dos fios tetrode e sua implantação no cérebro do inseto, bem como as técnicas de gravação de atividade elétrica e movimento e como esses dados podem ser reunidos para análise posterior.
Enquanto os estudos eletrofisiológicos anteriores sobre o CC ou de outras regiões do cérebro do inseto nos forneceu insights sobre a central de controle do comportamento, a maioria deles foram realizados tanto em preparações contido 9,11 ou aqueles amarrados 10,14. Como resultado, o animal de experiência sensorial e estado fisiológico pode ser muito diferentes daqueles em um ambiente natural. Além disso, as tarefas de comportamento que o animal pode realizar são limitados a um avião nessa…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem Nick Kathman para sugestões e ajudar na preparação para o manuscrito. Esta técnica foi desenvolvida em conjunto com o trabalho apoiado pela AFOSR sob concessão FA9550-10-1-0054 e da National Science Foundation, Grant No. IOS-1120305 para RER.
Nichrome wire | Sandvik Heating Technology | Kanthal RO-800 | Use for tetrode |
Biomedical polyethylene tubing | A-M Systems | 800700 | Use for tetrode tubing |
Lynx-8 | Neuralynx | Use for multi-unit recording | |
Cheetah 32 | Neuralynx | Use for multi-unit recording | |
High speed camera | Basler | A602f | Use fir video recording for walking experiments |
High speed camera | Casio | EX-FC150 | Use for video recording for climbing experiments |
WINanalyze | Winanalyze | version 1.4 3D | Use for video tracking |
Matlab | MathWorks | MATLAB R2012b | Use for TTL pulse generation and off-line data analysis |