Проприоцепция и Натяжные Рецепторы в Краб конечностей: Студент лабораторных занятий

1. Вскрытие и запись электрической активности от Проподит-dactylopodite (PD) нерва Держите краба через панциря сзади, и избегая когти, щепотка проксимального часть meropodite щипцами. Нога будет autotomize чтобы предотвратить животное от истекая кровью. Будьте осторожны при обращении синих крабов, как они довольно агрессивны и очень быстро. Рисунок 1. Впервые ходить ножку краба. Анатомического расположения хордотональные органов (вылупившиеся регионы) накладываются на этой схеме. Глава двойная стрелка указывает, где секут ногу для ПД нервных экспериментов. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение . Сделайте надрез между проподита и carpodite. Откажитесь от Карпоподит и т он придает meropodite (рис. 1). Вырезать большое окно в кутикулы на пигментной (боковой) стороне проподита скальпелем с # 11 лезвия (рис. 2 и 3). Примечание: Не врезаться глубоко. Удалить слой кутикулы, сдвинув лезвие скальпеля ниже и параллельно кутикулы. Это разрывает мышечные волокна, прикрепленные к кутикулы. Используя ту же технику вырезать окно меньшего размера на pigmentless (медиальная) стороне проподита, но оставить мыщелок (на шарнир или петель между сегментами) привязанность нетронутыми. Рисунок 2. Отрежьте по пунктирной линии на проподита. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение . н "Первоначально" / files/ftp_upload/51050/51050fig3.jpg "ширина =" 500px "/> Рисунок 3. Expose нерв в окне (стрелки очертить нервного пучка). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение . Подготовка Sylgard картонных блюдо в содержащий краба физиологический раствор, чтобы прикрепить подготовку вниз Примечание:. См. Таблицу 1 для видов конкретных засоленных рецептов. Найдите PD орган тщательно зондирования со стеклянными иглами огневой полировкой. Эластичная нить охватывающих сустав имеет серебряную внешний вид. Удалить мышечные волокна, затемняющие ваш взгляд на органе с обеих сторон сухожилия. Будьте очень осторожны, чтобы не повредить PD орган или его нерв. Как только это было сделано, твердо прикрепить подготовку к блюду с пигментной части (боковой) вверх (рис. 4). <img alt="Рисунок 4" fo:content-width= "5 дюймов" Первоначально "> Рисунок 4. Открытые PD орган и нерв. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение . Следуйте органов нерв PD в проподита насколько проксимально, насколько это возможно, чтобы освободить вверх длинный длину нерва (1,5 см) для звукозаписи. Лучше всего это делать в то время как ПД нерва все еще прикреплена к основной нерв ноги. После отделения PD нерв от главного нерва ноги с помощью стеклянных иголок, разорвать PD нерв проксимально с ножницами ириса Примечание:. Не растягивайте и не тяните нерва во время вскрытия. Перемещение dactylopodite в расширенный и полностью согнутом положении. Принять к сведению о том, где крайние сгибание и разгибание позиции и на полпути точкой для дальнейшего использования. Поместите провод заземления внутри солевой ванне. Включите еЗапись lectrophysiology аппаратного / программного обеспечения. Примечание: Наша установка была описана ранее 23. Расположите микроскопа так, чтобы он с видом на столик микроскопа. После того, как подготовительные блюдо ставится на сцене, вам нужно будет отрегулировать положение высокой осветителя пучка интенсивности, чтобы наилучшим образом визуализировать подготовку. Расположите микроманипулятор поэтому прилагается узел всасывающей электрод будет иметь легкий доступ к солевой ванне и подготовки. Всасывающий электрод выполнен, как показано в онлайн-видео 24. Для обнаружения нервную деятельность, привлечь срез ПФ нерва во всасывающий электрода. Перемещение дактиль всей длительных и согнутыми позиций для нескольких циклов с помощью стеклянной зонда или деревянный дюбель. Следующая наблюдать активность, когда дактиль закреплен в расширенных, согнутыми и середине позиций. 2. Запись электрической активности от напряженияНерв в то время как мониторинг формирования сил Определите латеральной и медиальной стороне ноги. Медиальная сторона имеет мягкую текстуру, что можно почувствовать, зажимая мягко в meropodite области с ногтем. Разместите эту мягкую кутикулу стороной вверх в блюдо. Возбудитель двигательного нерва, что иннервирует нож мышцы также иннервирует носилки мышцы в карпоподита. В целях стимулирования нож мышцы носилки двигательного нерва в carpodite региона выделяют и стимулировали всасывающим электродом. Ближняя часть ноги снимается, пересекающих meropodite ножницами. Удаление раздел кутикулы в регионе запястьевого на внутренней стороне (медиальной стороны, фиг.5А). Разрежьте аподема изгибающем мышцы и снять мышцы тщательно, чтобы не тянуть основную нерв ноги из полости ног (рис. 5б, в, обратите внимание на стрелки, где Бендер аподема отделяется). Главный нерв ноги и бюстгальтерNCH ​​на носилках мышцы то можно наблюдать (рис. 5D). Найти нерв ветвления от основного нервного пучка в носилках мышцы (рис. 5E, стрелкой). Это может быть срезаны близко к мышце и потянули в всасывающего электрода для стимуляции (рис. 5F и G, стрелка изображает филиал). Дразнить сечение нерва, который выступает в направлении открывания без зажимая нерв. Разрез на носилки / нож двигательного нерва. Потяните двигательного нерва во всасывающий электрода, а затем стимулировать его. Чтобы разоблачить нож мышцы и напряжение нерв удалить ближе мышцы и вентральной области проподита. Отрежьте ближе мышцы с помощью скальпеля с # 11 лопасти в проподита (рис. 6). Примечание: Не врезаться глубоко в проксимальной области, потому что это может привести к повреждению нож двигательного нерва. <img alt="Рисунок 5" fo:content-widtч = "5 дюймов" Первоначально "> Рисунок 5. Шаги Препарирование для разоблачения мотонейрона для стимулирования нож мышцы. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение . Рисунок 6. Вырезать кутикулу на брюшной половине проподита чтобы разоблачить ближе мышцы, поэтому он может быть удален. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение . Замените солевой раствор со свежим охлажденным физиологическим раствором на протяжении всего процесса вскрытия сохранить нейроны в живых. Для получения дополнительной вскрытия, поместите подготовки блюдо под микроскопом рассекает и использовать волоконно-оптический освещение. Аккуратно вырежьте ближе сухожилие от его привязанности кдактиль используя остроконечные ножницы средних. Будьте очень осторожны, чтобы не потревожить ветви к нож мышцы от главного нерва ноги, которая должна быть четко видны. Снимите и выбросьте ближе мышцы и сухожилия. Сделайте отверстие в пальце с рассечение штифта. Это отверстие будет использовано позднее зацепить металлический штифт на напряженности (силы) преобразователь, но надо сделать это на данном этапе процедуры. Найдите нерва филиал, который выступает в нож мышцы и аподемой в дистальной области нож мышцы. Тщательно исследовать нерв со стеклянным инструментом огневой полировкой. Соблюдайте нервное напряжение, которое возникает от дистального конца аподемой и переходит к двигателя нервного пучка. Для обнаружения нервную деятельность, заполнить всасывающий электрод с крабовым физиологическим раствором и привлечь обрезанный конец натяжения нерва нож в электрод. Убедитесь, что всасывающий электрод плотно на нерв. Изучите для Neuraл коррелятом пассивной напряженности на нож аподемой. Во время записи электрической активности от нерва натяжения, поверните дактиль быстро в расширенном сустава (т.е. растяжение нож мышцы). Затем тест развитие активной силой в отношении частоты стимуляции. Плотно прикрепить металлическую трубку таким образом, чтобы конец крюка проходит через небольшое отверстие в пальце. . Подключите другой конец металлическим крючком к датчику силы Примечание: Убедитесь, что датчик является под углом 90 ° каждый раз так, чтобы штифт перпендикулярно к преобразователю для максимального выявления силы, генерируемой. Вытяните крюк и дактиль так, чтобы она под углом примерно 45 ° от открывания сустава. Теперь стимулировать двигательного нерва при 100 Гц в течение 250 мс и измерения силы, а также огневую частоту нерва натяжения. Поместите сустав в полностью выдвинутом положении так, чтобы нож мышечные волокна вялым. Stimulate двигательного нерва при 100 Гц на 250 мс и измерить силу, а также огневую частоту нервное напряжение. Bend / сгибать сустав так, чтобы она полностью согнуты (~ 90 °). В этом положении мышечных волокон нож полностью растягивается. Там могут быть некоторые сила измеряется датчиком за счет этого пассивного растяжения мышцы. Стимулировать двигательного нерва при 100 Гц на 250 мс и измерить силу, а также огневую частоту нервное напряжение. После измерения силы, перейти в серии различных частотах: 20, 40, 60, 80, и 100 Гц для 8-10 сек в каждом совместной позиции. Измерьте ответ с быстрого освобождения натяжения. Организовать подготовку так, чтобы крючок на преобразователем силы может быть легко вытеснены из отверстия в пальце. Bend / сгибать сустав так, чтобы она полностью согнуты (~ 90 °). Теперь стимулировать двигательного нерва при 100 Гц с непрерывным стимуляции 5 сек. После первого вторичныхг или менее, как напряженность построена на нож мышцы, нажмите булавку из отверстия в пальце. Изучите записи натяжения нерва до и после выпуска штифта держа дактиль. Модулирующее воздействие нейроактивных веществ, таких как октопамину, серотонина и proctolin, которые изменяют выходные напряжения нейронов, может быть определена путем добавления этих молекул в купального сред на открытый нож мышцы и повторяя эксперименты. Используйте пипетку и закапать 1-2 мл за подготовкой. 3. Окрашивание периферической нервной системы структуры в ракообразных Прогулки Ноги Метиленовый синий техника Развести одну часть метиленового синего хлорида маточного раствора (0,25%) с двумя частями дистиллированной воды. Добавить эту смесь к пяти частях буферным раствором. Тщательно орошения область интереса. Проанализируйте ногу в соответствии с протоколом в разделе 1. Выдержите предварительноparation в раствора метиленового голубого на 12-13 ° С. Изучите препарату каждые 10-15 минут с микроскопом рассекает использованием низкой освещенности интенсивности, чтобы следить за ходом окрашивания. В некоторых случаях окрашивание будут завершены в течение часа, в других это может занять всю ночь. 4-ди-2-ASP техника Флуоресцентные красители могут быть использованы для резервного заполнить PD нейрон или непосредственно пятно подготовку из ванны. Однако подходит микроскоп с возможностями для просмотра флуоресцентного пятно требуется. Проанализируйте ногу в соответствии с протоколом в разделе 1. Инкубировать препарат в концентрации 10 мкМ раствора 4-ди-2-ASP и оставить препарат в холодильнике в течение 15 мин. Используйте достаточно просто решение для покрытия подготовку. Сфотографируйте препараты быстро и избежать чрезмерного воздействия ртути света. Это флуоресцентный краситель исчезает довольно быстро. <li> Cobalt техника хлорид Expose ПФ нерв в соответствии с протоколом в разделе 1, и держать его погружали в холодную физиологического раствора. Сделайте вазелин хорошо провести CoCl 2. Если CoCl 2 разливов в солевой ванне вся подготовка будет пятно черный, и подготовка должны быть отброшены. Скольжения небольшой разрез листа полистирола, чтобы сделать пластиковую платформу, и контактный его таким образом, что она не будет плавать в сторону или погружения в солевой ванне (рис. 7). Рисунок 7. Полистирол лист с контактами, чтобы удерживать на месте в блюдо. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение . Извлеките вазелин от штрафа иглы для подкожных инъекций, прикрепленной к одноразового шприца,затем сделать барьер (круг может хорошо работать), которая должна быть около 1-1,5 мм в высоту для пологой "V" в середине, где нерв будет завернуто в поперечнике, на вершине скольжения полистирола кроме. Сделать небольшую лужицу физиологического раствора по обе стороны барьера вблизи "V". Заботясь не растягивать или ущипнуть нерв, поднимите нерв тщательно от блюда и поместите его в солевом лужу в вазелин хорошо. Работают быстро, так что часть нерва не высыхает, тщательно извлечь вазелин для покрытия подвергаются нерв. Теперь проверьте барьер с физиологическим раствором и убедиться, что он не протекает. Пятно от солевой раствор на внутренней барьера и посмотреть, если он заполняется, когда ванна солевой высока вокруг стены вазелина, чтобы убедиться, что обе стороны изолированы друг от друга (рис. 8). <stro нг> Рисунок 8. Вазелин хорошо с физиологическим раствором и PD нерва охватывающих хорошо. PD нерв не были сокращены еще. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение . Фитиль от солевой в скважине с помощью кусок папиросной бумаги. Не позволяйте бумага обернуть нерв. Создайте новый лужу используя несколько небольших капель дистиллированной воды, а затем обрежьте нерва. Будьте очень осторожны, чтобы не тянуть нерв через барьер при резке. Осмотического шока дистиллированной воды будет "воздушный шар" аксоны. В 30 сек добавить небольшую каплю CoCl 2 к воде, понежиться это решение, а затем добавить достаточно CoCl 2, чтобы сформировать лужу над этим укороченным части нерва (рис. 9). Препараты лучше хранить в холодильнике при температуре 13 ° С в течение 12-24 часов. tp_upload/51050/51050fig9.jpg "ширина =" 500px "/> Рисунок 9. ПД нерва вырезать подвергаясь CoCl 2. Разрез нерва опухает в присутствии воды, что облегчает и ускоряет движение молекул красителя через аксонов в нейрон клеточных тел. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение . Удалите увлажняющие лужи. Пятно от раствора кобальта с помощью ткани и смыть остатки кобальта с несколькими изменениями физиологического раствора. Перенести изолированный подготовку к небольшой стеклянную чашку Петри, содержащей около 10 мл краба физиологического раствора. Нейроны промывают и следующие шаги выполняются на месте. Хорошие инструменты металлические, не должны использоваться для обработки подготовку после этого шага (вы должны использовать специальные инструменты, которые не будут использоваться в более позднее время для физиологии). Добавить 1-2 капли сульфида аммония (NH4) 2 S к физиологическим раствором. Закройте (NH 4) 2 S бутылку плотно и поместить обратно в капюшоне. Соблюдайте реакцию в подготовке при вскрытии микроскопом В 1-2 мин, кобальта заполненные нейроны и их процессы должны начинают появляться, потому что они будет пятно черного цвета. После 5-10 мин, замените решение для разработки со свежим раствором. Убедитесь, что решение для разработки вы выливают в канализацию раковины следует проточной водопроводной водой в течение нескольких минут или в сточных бутылки с крышкой. Вылейте физиологический раствор и фиксировать препарат нерва в течение приблизительно 15 мин с двумя изменениями раствора фиксатором Буэна. Для больших тканей, таких как нож мышцы (для окрашивания натяжных нейроны), увеличивают продолжительность фиксации до 30 мин. Высушить в серии порядке возрастания концентрации этанола, начиная с 70% (т.е. 70%, 80%, 90%, 100%). Приблизительно 10 минут при каждой концентрации достаточно длямаленькие ткани. Примерно через 10-15 минут в двух сменах 100% этанола, снимите ткань, заменяя этанол с 100% метилсалицилат. Подготовка останется в этом растворе постоянно для повторного просмотра. Со временем заполненные клетки станут более очевидными, поскольку окружающие ткани станут более ясными. Интенсификация методы могут быть использованы для предотвращения выцветания с течением времени 25. Используйте тот же самый процесс, чтобы заполнить нервное напряжение с CoCl 2. Тем не менее, изменить растворе этанола несколько раз в каждом стадии дегидратации этанола и инкубировать подготовку внутри алкоголя около 20 мин для каждого шага, чтобы тщательно обезвоживают мышцы и дать им возможность очистить хорошо.