게 사지에서 고유 감각과 긴장 수용체 : 학생 실험실 연습

1. Propodite-dactylopodite (PD) 신경의 해부 및 녹화 전기 활동 뒤에서 갑에 걸쳐 게를 잡고 발톱을 피하고, 집게로 meropodite의 근위 부분을 꼬집어. 다리는 죽음에 출혈 동물을 방지하기 위해 autotomize됩니다. 그들은 오히려 공격적이고 매우 빠르다으로 꽃게를 취급 할 때주의해야합니다. 그림 1. 먼저 게의 다리를 산책. chordotonal 기관 (빗금 친 지역)의 해부학 적 위치는이 도식에 겹쳐있다. 이중 화살표 머리는 어디 PD 신경 실험의 다리를 절개하는 방법을 나타냅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 . propodite과 carpodite 사이의 상처를 확인합니다. carpopodite와 t 폐기 그는 (그림 1) meropodite 붙어 있습니다. . 깊이 잘라하지 마십시오 # 11 블레이드 (그림 2, 3) 주와 함께 메스와 propodite의 색소 (측면) 측의 표피에있는 큰 창을 잘라. 아래의 메스 블레이드를 밀어 큐티클 층을 제거하고 표피에 평행. 이 표피에 부착 된 근육 섬유를 절단한다. 같은 기술을 사용하면 pigmentless propodite의 (중간) 측면에 작은 창을 잘라하지만 (소켓 관절 또는 세그먼트 사이에 힌지) 외과를 남겨 첨부 그대로. 그림 2. propodite에 점선을 따라 잘라. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 . N "SRC ="/ files/ftp_upload/51050/51050fig3.jpg "폭 ="는 500px "/> 그림 3. 창에서 신경 (화살표가 신경 다발 개요) 노출. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 . 아래 준비를 고정하는 게 생리 식염수가 들어있는 실 가드 늘어선 요리를 준비합니다 :. 종의 특정 생리 조리법 표 1을 참조하십시오. 조심스럽게 불 연마 유리 바늘을 프로빙하여 PD 기관을 찾습니다. 관절에 걸쳐 탄성 가닥은 외관이있다. 힘줄의 양쪽에서 기관의보기를 모호하게 근육 섬유를 제거합니다. PD 기관 또는 신경을 손상하지 않도록주의해야합니다. 이것이 달성되면, 단단히 (도 4)를 위로 향하게 (횡) 안료면이 접시를 다시 제조. <img alt="그림 4" fo:content-width= "5 인치"src = "/ files/ftp_upload/51050/51050fig4.jpg"폭 = "는 500px"/> 그림 4. PD 기관과 신경을 노출. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 . 무료 업하는 신경의 긴 길이 (1.5 cm)를 기록 목적을 위해서는까지 근위 가능한 propodite의 PD 장기 신경을 따르십시오. PD 신경이 여전히 주요 다리 신경에 연결되어있는 동안이 가장 잘 수행됩니다. 유리 바늘의 도움으로 주요 다리 신경의 PD 신경을 분리 한 후, 홍채 가위로 근위 PD 신경을 절단 참고 :. 해부 동안 스트레칭이나 신경을 당기지 마십시오. 확장 완전히 근육이 수축 위치로 dactylopodite 이동합니다. 극단적 인 굴곡 및 확장 위치가 나중에 사용하기 위해 중간 지점 위치에 대한 메모를 가져 가라. 식염수 화장실 내부에 접지선을 놓습니다. 전자를 켭니다lectrophysiology 기록 하드웨어 / 소프트웨어 참고 :. 우리의 설정은 이전에 23에 설명되어 있습니다. 그것은 현미경의 무대를 내려다되도록 현미경을 배치합니다. 준비 요리가 스테이지에 배치되면, 당신은 최고의 준비를 시각화하는 높은 강도의 조명 빔의 위치를​​ 조정해야합니다. 첨부 된 흡입 전극 어셈블리가 식염수 목욕 및 준비에 쉽게 액세스 할 수 있도록 미세 조작기를 놓습니다. 온라인 비디오 (24)에 나타낸 바와 같이 흡입 전극이 구성된다. , 신경 활동을 감지 흡입 전극에 PD 신경의 단면을 그립니다. 유리 프로브 또는 나무 다보의 도움으로 여러 사이클에 대한 확장과 근육이 수축 위치에 걸쳐 단단 격을 이동합니다. 단단 격이 확장 근육이 수축, 중간 위치에 고정 될 때 다음의 활동을 관찰합니다. 2. 긴장에서 전기 활동을 기록포스 세대에게 모니터링 신경 동안 다리의 외측과 내측을 결정합니다. 내측은 손톱으로 meropodite 지역에서 조심스럽게 집어 느낄 수있는 부드러운 질감이 있습니다. 접시에이 부드러운 표피면을 위로 놓습니다. 오프너 근육을 innervates excitor의 운동 신경도 carpopodite에 들것 근육을 innervates. 오프너 근육을 자극하기 위해 carpodite 지역 들것 운동 신경은 격리되어 흡입 전극과 자극. 다리의 기단 부분은 가위를 meropodite에 병행하여 제거된다. 안쪽의 손목 지역에있는 표피의 부분 (내측, 그림 5A)를 제거합니다. 벤더 근육의 apodeme를 잘라 다리 구멍 밖으로 주요 다리 신경을 당겨하지 않는주의 깊게 근육을 제거합니다 (그림 (b), C는 apodeme가 분리 벤더 화살표를 참고). 주요 다리 신경과 브라NCH는 들것 근육에 다음 (그림 5D) 관찰 할 수있다. 들것 근육 (화살표의 그림 5E)의 주요 신경 번들에서 분기 신경을 찾을 수 있습니다.이 주변 근육을 잘라 자극하는 흡입 전극으로 당겨질 수있다 (그림 5 층과 G를, 화살표는 지점을 나타낸다). 신경을 곤란하게하지 않고 오프너를 향해 돌출 신경의 한 부분을 애무 해줘. 들것 / 오프너 운동 신경을 절개. 흡입 전극에 운동 신경을 당긴 다음을 자극한다. 오프너 근육과 긴장의 신경을 노출하는 것은 가까이 근육과 propodite의 복부 지방을 제거합니다. propodite에서 # 11 블레이드 (그림 6)와 함께 메스와 가까운 근육을 잘라 주 :.는 오프너 운동 신경에 손상을 줄 수 있기 때문에 인접 지역에 깊이 잘라하지 마십시오. <img alt="그림 5" fo:content-width = "5 인치"src = "/ files/ftp_upload/51050/51050fig5.jpg"폭 = "는 500px"/> 그림 5. 오프너 근육을 자극의 운동 신경 세포를 노출 해부 단계. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 . 그림 6. 이 제거 될 수 있도록 가까운 근육을 노출 propodite의 복부 절반에 표피를 잘라. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 . 살아있는 뉴런을 유지하기 위해 해부 과정을 통해 신선한 냉각 식염수 식염수를 교환한다. 더 해부, 해부 현미경 준비 접시를 놓고 광섬유 조명을 사용합니다. 조심스럽게 그것의 첨부 파일에서 가까운 힘줄을 잘라뾰족한 중간 크기의 가위를 사용하여 단단 격. 명확하게 볼 수 있어야 주요 다리 신경에서 오프너 근육에 지점을 방해하지 않도록주의해야합니다. 제거하고 가까이 근육과 힘줄을 버린다. 해부 핀으로 단단 격에 구멍을 확인합니다. 이 구멍은 텐션 (포스) 변환기에 금속 핀을 연결하기 위해 사용될 것이지만,이 절차의 단계에서이를 확인하는 것이 필요하다. 오프너 근육의 말단 지역의 오프너 근육과 apodeme에 프로젝트 신경 분기를 찾습니다. 조심스럽게 불 연마 유리 도구를 사용하여 신경을 조사. 운동 신경 다발에 apodeme 진행의 말단부에서 발생하는 긴장의 신경을 준수하십시오. 신경 활동을 감지 게 식염수로 흡입 전극을 채우고 전극에 오프너 긴장 신경의 단면을 그립니다. 흡입 전극이 신경에 단단하게 설치되었는지 확인합니다. neura에 대한 검사오프너 apodeme에 수동 긴장의 L의 상관 관계. 긴장 신경의 전기적 활동을 기록하는 동안 (즉, 오프너 근육을 스트레칭) 확장 공동으로 급속하게 단단 격을 돌립니다. 다음으로, 자극 주파수 관련 테스트 활동력 전개. 후크의 끝이 단단 격에있는 작은 구멍을 통해 들어가도록 단단히 금속 걸이를 부착합니다. . 힘 센서로 금속 걸이의 다른 쪽 끝을 연결 참고 : 핀이 수직으로 발생하는 힘의 최대 탐지를위한 변환기에되도록 트랜스 듀서는 90 ° 각도마다 있는지 확인합니다. 이 오프너 공동의 약 45 ° 각도가되도록 후크와 단단 격을 당깁니다. 지금 250 밀리 초, 100 Hz에서 운동 신경을 자극하고 박력뿐만 아니라 인장 신경의 소성 주파수를 측정한다. 오프너 근육 섬유가 이완되도록 완전히 확장 된 위치로 관절을 놓습니다. 에스250 밀리 초 100 Hz에서 운동 신경을 timulate와 힘뿐만 아니라 긴장의 신경의 발사 주파수를 측정합니다. 완전히 (~ 90 °) 근육이 수축되도록 벤드 / 관절을 구부리. 이 위치에서 오프너의 근육 섬유가 완전히 뻗어있다. 때문에 근육의 수동적 스트레칭 변환기에 의해 측정 어떤 힘이있을 수 있습니다. 250 msec의 100 Hz에서 운동 신경을 자극하고 박력뿐만 아니라 인장 신경의 소성 주파수를 측정한다. 힘을 측정 한 후, 다양한 주파수의 일련의 진행 각 관절 위치에서 80-10 초 동안 20, 40, 60, 80, 및 100 Hz에서. 빠른 긴장의 출시와 함께 응답을 측정한다. 힘 센서에 후크가 쉽게 단단 격에서 홀의 압출 될 수 있도록 준비를 준비한다. 완전히 (~ 90 °) 근육이 수축되도록 벤드 / 관절을 구부리. 이제 5 초 연속 자극 100 Hz에서 운동 신경을 자극한다. 첫 번째 SECON 후긴장 오프너 근육에 구축했다로 D 이하, 단단 격에 구멍의 핀을 밀어. 단단 격을 들고 핀의 출시 이전과 이후의 긴장 신경 기록을 검사합니다. 그러한 장력 뉴런의 출력을 변경 옥토 파민, 세로토닌 및 proctolin 같은 신경 활성 물질이 조절 성 효과는 노출 오프너 근육 위에 입욕 매체에이 분자를 첨가하고 실험을 반복함으로써 결정될 수있다. 피펫을 사용하고 준비에 1 ~ 2 ㎖의 드립. 3. 갑각류에서 염색 말초 신경계의 구조는 다리 산책 메틸렌 블루의 기술 증류수의 두 부분으로 한 부분 메틸렌 블루 염화 원액 (0.25 %)를 희석. 완충 용액의 다섯 부분이 혼합물을 추가합니다. 철저하게 그 지역을 관개. 섹션 1의 프로토콜에 따라 다리를 해부하다. 사전을 품어12 ~ 13 ℃에서 메틸렌 블루 용액에 paration 준비에게 염색의 진행을 따라 낮은 강도의 조명을 사용하여 해부 현미경으로 매일 10 ~ 15 분을 검사합니다. 염색은 다른 사람에, 시간에 완료 될 경우에 따라서는 하룻밤 걸릴 수 있습니다. 4 – 디 -2 – ASP 기법 형광 염료는 다시 – 채우기 PD 신경 세포를 직접 화장실에서 준비를 염색하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 형광 얼룩을 볼 수있는 능력을 가진 적당한 현미경이 필요합니다. 섹션 1의 프로토콜에 따라 다리를 해부하다. 4 – 디 -2 – ASP 용액 10 μM 농도의 제제를 부화하고 15 분 동안 냉장고에 제제를 남긴다. 준비를 충당하기 위해 충분한 솔루션을 사용합니다. 빨리 준비를 사진과 수은 빛에 노출을 통해 피하십시오. 이 형광 염료는 비교적 빨리 사라진다. <li> 염화 코발트 기법 섹션 1의 프로토콜에 따라 PD 신경을 노출하고 차가운 식염수에 담가 보관. 의 CoCl2를 개최 젤리 아니라 석유를 확인합니다. 임의의 CoCl2은 생리 욕조에 유출하는 경우 전체 준비는 검은 얼룩하고, 준비는 폐기해야합니다. , 폴리스티렌 시트의 작은 컷 미끄러짐 플라스틱 플랫폼을 만들고, 그것을 멀리 float 또는 (도 7) 식염수 욕에 침지되지되도록 수행 그것을 핀. 접시에 장소에서 개최 핀 그림 7. 폴리스티렌 시트. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 . 일회용 주사기에 고정 벌금 피하 주사 바늘에서 석유 젤리를 추출,다음 신경 폴리스티렌의 슬립의 상단에 걸쳐 드리 워진됩니다 중간에 얕은 "V"를 제외하고 높은 약 1.5 mm이어야한다 장벽 (원형이 잘 작동하지 않을 수 있습니다)합니다. "V"근처 장벽의 양쪽에 생리 식염수를 작은 웅덩이를 확인합니다. 늘리거나 끼 신경을 요리에서주의 깊게 신경을 올리고 젤리 아니라 석유의 식염수 웅덩이에 배치되지 않도록주의. 신경의 부분이 노출 된 신경을 충당하기 위해 석유 젤리를 꺼내 조심스럽게 건조하지 않도록 신속하게 작업 할 수 있습니다. 지금 식염수 장벽을 테스트하고 확인이 새는되어 있는지 확인합니다. 장벽 안쪽에 식염수를 멀리 몰아 내고 목욕 식염수 양측 (그림 8) 서로 격리되어 있는지 확인하기 위해 바셀린의 벽 주위에 높은 경우가 차면 참조하십시오. <stro ng> 그림 8. 석유 젤리 잘 식염수와 PD 신경도에 걸쳐있는. PD 신경 아직 절단되지 않았습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 . 잘 티슈 종이를 사용하여 식염수 멀리 심지. 용지가 신경을 감싸주는 마십시오. 증류수 약간 작은 방울을 이용하여 새로운 웅덩이를 확인한 후 신경 말단을 잘라. 컷을 할 때 장벽을 통해 신경을 당겨지지 않도록주의하십시오. 증류수의 삼투압 충격 것 "풍선"축삭. 30 초 이내, 물에의 CoCl2의 작은 방울을 추가하고이 액을 흡수하고 신경이 단축 섹션 (그림 9)에 웅덩이를 형성 할만큼의 CoCl2를 추가합니다. 준비는 최고 12 ~ 24 시간 동안 13 ° C에서 냉장 보관됩니다. tp_upload/51050/51050fig9.jpg "폭 ="는 500px "/> 그림 9. 컷 PD 신경이의 CoCl2에 노출된다. 절단 된 신경은 신경 세포체에 축삭을 통해 염료 분자의 이동을 용이하게하고 가속화 물의 존재에 오릅니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 . 가습 웅덩이를 제거합니다. 조직을 사용하여 코발트 솔루션을 멀리 몰아 내고 식염수 몇 가지 변경 사항과 코발트의 흔적을 씻어. 게 식염수의 약 10 ㎖가 들어있는 작은 유리 페트리 접시에 고립 된 준비를 전송합니다. 뉴런은 세척 및 다음 단계는 인 시츄로 수행된다. 기대 금속 툴이 단계 후에 제제를 (만약 생리학 나중에 사용할 수없는 특정 도구를 사용한다)를 처리하는 데 사용되어서는 안된다. (황화 암모늄 1 ~ 2 방울을 추가 NH4) 생리 식염수에 2 S. 단단히 (NH 4) 2 S 병 캡을 다시 후드에 배치합니다. 해부 현미경 제조에서 반응을 관찰 1 ~ 2 분 이내에, 코발트 가득 뉴런과 그 프로세스는 검은 얼룩 때문에 나타나기 시작한다. 5 ~ 10 분 후, 신선한 식염수 개발 솔루션을 교체합니다. 당신은 싱크대 배수구에 부어 한 개발 솔루션이 몇 분 동안이나 뚜껑이있는 폐기물 병에 수돗물을 실행하여 다음 않았는지 확인합니다. 식염수를 붓고 Bouin의의 솔루션 정착의 두 가지 변경 사항과 약 15 분 동안 신경 준비를 고정합니다. 오프너 근육 같은 큰 조직의 경우 (긴장 뉴런을 염색하기 위해), 30 분에 고정의 지속 시간을 증가시킨다. 70 % (즉, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %)에서 시작하여 에탄올 농도의 오름차순으로 직렬로 탈수. 각각의 농도에서 약 10 분에 충분하다작은 조직. 100 % 에탄올 두 가지 변경에 대해 10 ~ 15 분 후, 100 % 메틸 살리 실 레이트와 에탄올을 대체하여 조직을 취소합니다. 준비는 반복 시청을 위해 영구적으로이 솔루션에 남아있을 것입니다. 주변 조직이 명확하게 될 것입니다 때문에 시간 채워진 세포는 더 명백해질 것이다. 강화 방법은 25 시간 동안 페이딩 방지하기 위해 사용될 수있다. 의 CoCl2와 긴장의 신경을 ​​채우기 위해 동일한 프로세스를 사용합니다. 그러나 각 에탄올 탈수 공정에서 에탄올 용액을 여러 번 변경하고 철저하게 근육을 탈수하고 잘 취소 할 수 있도록 각 단계에 약 20 분 동안 알코올 내부 준비를 품어.